Evidências de proteínas, cromossomos e marcadores químicos de DNA na cartilagem de dinossauros excepcionalmente preservada
Alida M Bailleul
Laboratório-chave de evolução de vertebrados e origens humanas,
Instituto de Paleontologia e Paleoantropologia de Vertebrados, Academia
Chinesa de Ciências
, Beijing 100044,
China
Centro CAS de Excelência em Vida e Paleoambiente
, Beijing 100044,
China
Pesquise outros trabalhos deste autor em:
National Science Review , nwz206, https://doi.org/10.1093/nsr/nwz206
Publicados:
12 de janeiro de 2020
Abstrato
INTRODUÇÃO E OBSERVAÇÕES HISTOLÓGICAS
Um terreno de nidificação que produz dezenas de filhotes desarticulados atribuídos ao dinossauro herbívoro Hypacrosaurus stebingeri foi descoberto na década de 1980 na formação de dois medicamentos do Cretáceo Superior (Campaniano) do norte de Montana (Museu das Montanhas Rochosas, MOR 548, localidade TM-066, Texto complementar 1 ) [ 1 , 2 ]. Vários elementos dos membros e do crânio desses filhotes foram submetidos a análises microscópicas para responder a perguntas relacionadas ao crescimento [ 1 ] e para descrever diferentes tipos de cartilagem [ 3 ]. A cartilagem calcificada vista em um supraoccipital em corte no solo foi especialmente interessante (Fig. 1 B – D). Dentro da junção condro-óssea (ou seja, a parte da placa de crescimento onde o osso substitui a cartilagem) mais próxima do exoccipital esquerdo, os tecidos apresentaram excelente preservação microscópica, de modo que a cartilagem poderia ser distinguida do osso por exibir uma matriz extracelular translúcida e amorfa ( MEC) e lacunas condrocíticas hipertróficas redondas (Fig. 1B ). Em aumento maior, foram observadas estruturas celulares ainda compartilhando uma única lacuna (isto é, um dupleto de células) [ 4 , 5 ], consistente com condrócitos no final da mitose (Fig. 1 C, seta rosa; Fig. 1 suplementar ). Embora muitas lacunas pareçam vazias (Fig. 1 B e C, seta verde), outras lacunas (seta rosa) contêm um material distinto da matriz, incluindo um material mais escuro, consistente em forma e localização com um núcleo (Fig. 1 C, branco). Setas; flechas). Isso é comparável às características da cartilagem calcificada existente [ 4 ] observada em seções do solo de crânios de emu juvenis, onde algumas lacunas estão vazias e outras retêm células e conteúdos intracelulares, incluindo núcleos (Fig. 1G ).
Figura 1.
A seção no solo do hipocrosauro (MOR 548) supraoccipital mostra preservação histológica excepcional da cartilagem calcificada. (A) Um supraoccipital isolado (So) do Hypacrosaurus em vista dorsal. (B – D) Corte no solo de outro So mostrando cartilagem calcificada com lacunas de condrócitos hipertróficas.
(C) Alguns dupletos de células parecem vazios (seta verde), mas outros
(seta rosa) apresentam material condensado mais escuro, consistente em
forma e localização com um núcleo (setas brancas). (D) Material escuro, condensado e alongado com características morfológicas dos cromossomos da metáfase. O limite da lacuna celular é visível (seta preta).
(E) Vista caudal de um crânio de emu juvenil (entre 8 e 10 meses de
idade) mostrando o So e os exoccipitais (Exo) em articulação.
(F, G) Seção no solo (corada com azul de toluidina) da cartilagem
calcificada deste crânio do emu mostrando dupletos celulares (setas cor
de rosa) com restos de núcleos (setas brancas) e outros sem conteúdo
intracelular (seta verde).
Nossa hipótese foi de que essa preservação morfológica excepcional se estenderia ao nível molecular quando métodos comumente usados para identificar marcadores moleculares e químicos na cartilagem existente fossem aplicados a esses tecidos fósseis. Para testar esta hipótese, investigamos a preservação molecular da cartilagem de Hypacrosaurus nos níveis extracelular, celular e intracelular em outro supraoccipital do mesmo local de nidificação (Fig. 1A ), de tamanho semelhante àquele em que essas estruturas foram originalmente observadas (Fig. 1 B – D). A amostra deste estudo não havia sido incorporada anteriormente em resina. Aproveitamos as diferenças químicas distintas entre cartilagem e osso dentro deste segundo supraoccipital do Hypacrosaurus (Fig. 1A ) e usamos os supraoccipitais do ema juvenil ( Dromaius novaehollandiae ) como homólogos existentes.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Histologia
Durante a ontogenia, o supraoccipital surge como uma cartilagem primária que é então substituída pelo osso via ossificação endocondral [ 3 ]. O crescimento ocorre principalmente na junção condro-óssea, onde os condrócitos sofrem divisão celular e hipertrofia. Os condrócitos envolvidos nas lacunas secretam componentes da MEC, incluindo colágeno II e glicosaminoglicanos [ 4 , 8 ]. Por outro lado, osteoblastos e osteócitos secretam colágeno tipo I, quantidades mínimas de glicosaminoglicanos [ 9 ] e proteínas não colágenas [ 10 ].Os condrócitos hipertróficos da junção condro-óssea têm destinos diferentes ( Texto Complementar 2 ), mas muitos sofrem morte celular [ 4 , 5 , 11 ], resultando eventualmente em lacunas vazias (por exemplo, Fig. 1G ), seguidas de substituição por osso [ 4 , 12 ] Embora uma célula fóssil preserve estruturas morfologicamente consistentes com os cromossomos mitóticos na metáfase (Fig. 1D ), propomos, com base em comparações vivas, que ela não está em divisão celular normal, mas apresenta as características de um condrócito hipertrófico em estágio inicial de morte celular denominada condroptose [ 11 , 13 , 14 ] ( Fig. 1 complementar ; Texto complementar 2, 3 ). Nesse tipo de mitose anormal, especificamente identificada nos condrócitos hipertróficos senescentes das placas de crescimento aviário, o DNA condensa e os cromossomos adotam um arranjo semelhante à metáfase [ 13–15 ] ( Texto Complementar 2 ).
Histoquímica
A MEC da cartilagem e ossos existentes pode ser diferenciada usando o azul Alcian, uma mancha histoquímica que reage intensamente com materiais ácidos e muito menos com materiais básicos. A cartilagem incorpora mucinas ácidas e glicosaminoglicanos não encontrados no osso [ 4 , 16 ]. O azul alciano foi empregado anteriormente para diferenciar tecidos no Tyrannosaurus rex [ 16 ] e Yanornis martini [ 17 ]; nós a aplicamos aqui para secções de parafina da cartilagem e osso desmineralizados do Hypacrosaurus . A cartilagem fóssil (Fig. 2C ) e existente (Fig. 2G ) demonstraram intensa coloração quando comparadas com osso desmineralizado corado dos mesmos organismos (Fig. 2 D, H), apoiando a diferenciação química entre os tecidos de dinossauros semelhantes aos observados nos tecidos existentes , e sugerindo a preservação da química original nesses tecidos antigos.
Figura 2.
A coloração histoquímica do azul de alciano capitalizou a presença
diferencial de glicosaminoglicanos na cartilagem calcificada e no osso
do Hypacrosaurus . Seções de parafina não coradas (A, B, E, F) e azul-alciano (C, D, G, H) de parafina do Hypacrosaurus e cartilagem e osso do emu. Uma forte coloração azul positiva é observada na cartilagem do Hypacrosaurus (C), comparável à intensa, porém mais escura, encontrada na cartilagem moderna da emu (G). Isso sugere que os glicosaminoglicanos ainda estão presentes na matriz cartilaginosa deste dinossauro. Por outro lado, os ossos fósseis e existentes mostram uma mancha azul muito clara (D, H). As imagens estão na mesma escala.
Imunofluorescência e imuno-histoquímica
A imuno-histoquímica apóia a persistência de epítopos proteicos consistentes com o colágeno II (Fig. 3 ), a proteína mais abundante que compreende a MEC da cartilagem existente [ 4 ]. Secções ultrafinas da cartilagem desmineralizada de Hypacrosaurus foram expostas a anticorpos criados contra o colágeno aviário II. A fluorescência verde nos tecidos reflete a localização dos complexos anticorpo-antígeno (Fig. 3B ). Na cartilagem existente do emu, a ligação está presente em toda a matriz (Fig. 3F ). A ligação na cartilagem fóssil é representada por um padrão mais globular (Fig. 3B ), sugerindo que os epítopos de colágeno II preservados não são distribuídos homogeneamente na MEC deste hipacrosauro . Além disso, a imunorreatividade na cartilagem do Hypacrosaurus é diminuída quando comparada ao emu (Fig. 3F ), conforme ilustrado por tempos de integração mais longos e sinal mais fraco. Isso pode indicar que menos epítopos são preservados nos tecidos antigos ou, alternativamente, que há mais distância filogenética entre as proteínas de dinossauros e as proteínas de galinha usadas para gerar o anti-soro. Se este último, nem todos os epítopos estariam presentes no dinossauro vivo.
Figura 3.
Coloração imuno-histoquímica da cartilagem de Hypacrosaurus . (A, C, E, G, I, K) são imagens de sobreposição mostrando cartilagem e ligação localizada; (B, D, F, H, J, L) são imagens fluorescentes usando o rótulo FITC. A cartilagem calcificada do hipacrosauro
(A, B) mostra coloração positiva localizada localizada quando exposta a
anticorpos (Ab) criados contra o colágeno II aviário, com sinal verde
fluorescente representando complexos anticorpo-antígeno dispostos
globularmente na matriz extracelular.
A imunorreatividade é diminuída, conforme ilustrado pelo tempo de
integração mais longo e pelo sinal mais fraco, quando comparado à
cartilagem calcificada e hialina de um ema (E, F). A reatividade do anticorpo diminuiu após a digestão da colagenase II no Hypacrosaurus (C – D) e cartilagem do emu (G – H), demonstrando que a reatividade ao colágeno II é específica para epítopos dessa proteína. O hipacrosauro
(I, J) e a cartilagem do emu (K, L) não mostram manchas quando expostos
a anticorpos chovidos contra o colágeno I. das aves. As imagens estão
na mesma escala.
Isolamento de condrócitos e ensaios de DNA
Embora os osteócitos tenham sido previamente isolados do osso do dinossauro [ 19 , 20 ], aqui mostramos os primeiros condrócitos isolados do dinossauro (Fig. 4 ). Ao contrário dos osteócitos de dinossauros que geralmente apresentam um tom avermelhado devido a inclusões de ferro [ 21 ], os condrócitos do Hypacrosaurus são transparentes (Fig. 4 A e B), sugerindo um modo de preservação diferente. Eles não possuem filopodia e apresentam a morfologia redonda consistente com todos os condrócitos vertebrados [ 22 ] (incluindo a emu, Fig. 4E ), mas distintos da forma fusiforme dos osteócitos [ 20 ]. Alguns dupletos celulares também foram isolados no Hypacrosaurus (por exemplo, Fig. 4B ).
Figura 4.
Condrócitos isolados de Hypacrosaurus e sua resposta positiva a dois ensaios de DNA. (A, B, E) Condrócitos isolados de Hypacrosaurus e emu fotografados sob luz transmitida (setas verdes). Os condrócitos do hipacrosauro foram isolados com sucesso como células individuais (A) e dupletos celulares (B). Hipacrosauro
(C) e emr condrócitos (F) mostrando resposta positiva ao iodeto de
propídio (PI), um corante intercalante de DNA, a uma região pequena e
circular que se localiza intracelularmente (setas brancas). O hipacrosauro
(D) e os condrócitos do emu (G) também mostram uma ligação semelhante
quando expostos ao dicloridrato de 4 ', 6′-diamidino-2-fenilindol
(DAPI), outra mancha específica do DNA (setas pretas), embora em ambos
os casos a célula do emu a coloração é significativamente maior do que
nas células dos dinossauros.
A coloração específica de PI (Fig. 4C ) e DAPI (Fig. 4D ) é observada dentro das células da cartilagem isolada do Hypacrosaurus , seguindo o padrão observado nas células existentes (Fig. 4 F e G), mas diminuindo nas antigas. Isso não apenas sustenta que o composto dentro dessas células é quimicamente consistente com o DNA, mas que o material é de fita dupla e com um comprimento mínimo de 6 pares de bases [ 24 ]. Essas moléculas devem ser reduzidas em concentração em relação às existentes por causa da área bastante reduzida manchada; esse padrão também foi observado com osteócitos de dinossauros (em Tyrannosaurus rex e Brachylophosaurus canadensis ) [ 20 ]. A alteração tafonômica típica do DNA envolve, entre outros processos, a quebra da coluna vertebral [ 26 ], fenômeno que se espera ter ocorrido nas células dessa antiguidade. Além disso, como a mancha de IP nas células fósseis se localiza em uma área tão pequena, isso pode indicar que o material nuclear estava em um estado condensado no momento da morte. A condensação do DNA ocorre naturalmente durante a mitose, a interfase e todos os tipos de morte celular ( Texto Complementar 2 ) [ 27 , 28 ]. Como as células isoladas do Hypacrosaurus provêm da junção condro-óssea, onde a maioria dos condrócitos morre, é possível que as células que exibem a coloração de PI e DAPI (Fig. 4 C e D) sejam senescentes (por exemplo, células condroptóticas ou apoptóticas) , com material nuclear condensado. Os condrócitos senescentes existentes podem mostrar diferentes morfologias do material nuclear condensado (com ou sem uma membrana nuclear fragmentada), como grânulos de cromatina condensada, um arranjo semelhante ao cromossomo ou múltiplas condensações apoptóticas ( Texto Complementar 2, 3 ).
Uma hipótese alternativa, de que a coloração decorre de contaminante microbiano, não é suportada ( contra [ 25 , 29 ]); não há mecanismo para o DNA exógeno penetrar em uma membrana intacta e localizar em um único ponto especificamente dentro da célula, demonstrando não haver reatividade em nenhuma outra região. Advertimos que apenas o seqüenciamento do material reativo ao PI e ao DAPI pode confirmar que ele é de origem dinossauro, no entanto, os dados combinados nos níveis histológico, celular e molecular (Figs. 1 - 4 ) suportam firmemente a hipótese de que a cartilagem de O hipacrosauro possui restos de condrócitos originais, material nuclear original e compostos endógenos quimicamente consistentes com o DNA. Além disso, esses dados suportam estruturas estruturadas morfologicamente com núcleos e cromossomos, vistas pela primeira vez em seções petrográficas do solo (Fig. 1 ; Fig. 1 complementar ) são endógenas a esse dinossauro. Embora tenha sido sugerido que estruturas semelhantes a células semelhantes recuperadas nos ossos de dinossauros possam ser o resultado da infiltração de biofilme [ 25 ], o padrão de reatividade observado quando o biofilme foi exposto à coloração por DAPI e PI durante um estudo anterior [ 20 ] é inconsistente com o observado aqui. É razoável e lógico propor que o osso fóssil de dinossauro contenha comunidades microbianas contaminantes [ 29 ], mas o caso específico que apresentamos aqui, onde condrócitos isolados mostram reatividade intracelular com PI e DAPI (Fig. 4 ), não corresponde ao padrão de coloração de 'aglomerados de células' de biofilmes contaminantes [ 29 ].
Mostramos que a cartilagem encontrada no MOR 548 é extremamente bem preservada, não apenas no nível histológico com um tipo de preservação subcelular não relatada (Fig. 1 ; Fig. 1 complementar ), mas também nos níveis celular e molecular (Figs 2 - 4 ). Este estudo fornece a primeira demonstração química e molecular clara da preservação da cartilagem calcificada no material esquelético mesozóico e sugere que, além do colágeno II específico da cartilagem, DNA ou pelo menos os marcadores químicos do DNA (por exemplo, pares de bases quimicamente alteradas que ainda pode reagir a PI e DAPI), pode preservar por milhões de anos.
A suposição de um limite temporal para a longevidade molecular dificultou a busca de dados moleculares de fósseis com mais de ± 1 milhão de anos (MA). É previsto um curto intervalo temporal para biomoléculas informativas (± 1 MA para proteínas e ± 100.000 anos para DNA; sendo 700.000 anos como o mais antigo relatório genoma) [ 30–32 ]. No entanto, essas suposições foram contestadas por vários estudos sobre restos fósseis mesozóicos que relatam evidências de remanescentes químicos e orgânicos, incluindo proteínas e pigmentos extracelulares (por exemplo, [ 33–37 ]), proteínas citoesqueléticas [ 20 ], compostos que se localizam no interior das células que são quimicamente consistentes com o DNA [ 20 ;e o presente estudo] e dados da sequência peptídica, incluindo proteínas histonas, uma proteína não encontrada em bactérias [ 38–40 ].
Aqui, dados derivados da cartilagem calcificada de dinossauros aumentam as evidências crescentes em espécimes e biomoléculas de que orgânicos endógenos originais permanecem em tempo profundo em condições excepcionais. Curiosamente, todos os materiais coletados neste local de nidificação foram desarticulados, sugerindo que um fenômeno diferente do enterro rápido permitiu uma preservação tão requintada ( Texto Complementar 1 ). Outro material de hadrosauro juvenil da formação Two Medicine mostrou excelente preservação da cartilagem [ 41 ]. A cartilagem calcificada pode representar um candidato melhor que o osso para a preservação de biomoléculas, porque exibe múltiplos fatores que contribuem para a estabilização molecular [ 42] Isso inclui um MEC sem vascularização, tornando-o menos poroso, com menos área de superfície disponível para águas subterrâneas e micróbios que resultam em biodeterioração; um MEC com uma proporção mineral: orgânica mais alta que a do osso [ 43 ]; e hipóxia [ 44 ]. Os níveis de oxigênio são mais baixos especificamente na zona de condrócitos hipertróficos calcificados, que podem servir para seqüestrar células, evitando danos oxidativos.
CONCLUSÕES
A identificação de marcadores químicos de DNA no Hypacrosaurus sugere que ele possa preservar muito mais tempo do que o originalmente proposto [ 30 , 31 ]. Embora seja claro que a contaminação exista em material fóssil e complique a identificação de moléculas orgânicas originais, ela pode ser explicada com controles adequados. A contaminação não é uma explicação plausível neste caso e, até a presente data, a possível preservação de proteínas e DNA originais em tempo profundo não foi eliminada de forma convincente com os dados. Embora seja necessária uma extensa pesquisa e sequenciamento para entender melhor a preservação do DNA no material mesozóico, juntamente com suas alterações químicas e moleculares, nossos dados sugerem o material nuclear preservado no Hypacrosaurusestava em um estado condensado no momento da morte do organismo, o que pode ter contribuído para sua estabilidade. Propomos que a condensação do DNA possa ser um processo favorável à sua fossilização. Além disso, como foi sugerido para a fossilização de proteínas [ 20 , 45 , 46 ], a reticulação pode ser outro mecanismo envolvido na preservação do DNA em tempo profundo.MÉTODOS
Todos os ensaios utilizando material fóssil foram realizados em instalações de laboratório dedicadas a análises fósseis, utilizando técnicas assépticas, e nunca entraram em contato com tecidos homólogos do emu usado como controle positivo. Os últimos foram analisados em um laboratório separado, usando instrumentos e soluções dedicados.Material fóssil
Foram utilizados dois supraoccipitais desarticulados (ossos do basânio) de Hypacrosaurus stebingeri (MOR 548) que eram semelhantes em tamanho e estado de preservação. O primeiro foi incorporado em resina de poliéster e preparado no MOR na década de 1980 (Fig. 1 B – D). Como a resina interfere com alguns métodos moleculares, um segundo supraoccipital não embebido (Fig. 1A ) do mesmo local fóssil foi escolhido para realizar análises químicas e moleculares (Figs. 2 - 4 ). Com base em seu tamanho, estima-se que esses elementos pertencem a filhotes com comprimento de crânio de cerca de 20 cm e comprimento total total de 2 m [ 1 , 3 ]. Os adultos desta espécie geralmente atingem um comprimento total de 9 m [47 ]Material existente
Utilizamos um total de quatro emas juvenis ( Dromaius novaehollandiae ) doados cadavéricos ao MOR pelo Montana Emu Ranch, entre algumas semanas e alguns meses após a eclosão (entre 8 e 10 meses). Dois foram mantidos congelados e dois foram enviados para uma colônia dermestídeo de besouros e destruídos para outros estudos em crânios de emu [ 48 ] (em crânios de emu, a maioria da cartilagem hialina e não mineralizada é ingerida por besouros, deixando principalmente a cartilagem calcificada). Os dados para a seção do solo (Fig. 1 E – G) são do crânio do emu MOR OST 1802 [ 48 ]. A coloração histoquímica, imunológica e de DNA foi realizada nas outras três amostras de emu na junção supraoccipital-exoccipital (homóloga à região da cartilagem calcificada de interesse no Hypacrosaurus )Secções no solo
Um supraoccipital do MOR 548 foi incorporado integralmente em resina de poliéster (de acordo com métodos padrão) [ 49 ]. Uma fatia relativamente grossa tirada usando uma serra de precisão Buehler Isomet 1000 foi anexada a uma lâmina de vidro com epóxi e moída na espessura desejada (100 mícrons) com um moedor Buehler Ecomet. A lâmina (Fig. 1 B-D) foi estudada por microscopia óptica sob luz transmitida com um microscópio de polarização Nikon Optiphot-Pol. As fotografias foram tiradas com uma câmera digital Nikon DS-Fi1 e o software NIS ELEMENTS BR 4.13.Para comparação com o material de emu existente (Fig. 1 E-G), fragmentos incluindo articulações cartilaginosas básicas do crânio (sincrondroses) do crânio do MOR OST 1802 foram extraídos com dremel e lâmina de diamante, fixados em formalina tamponada neutra a 10% (NBF), e ainda preparado para incorporação e corado com azul de toluidina ( métodos suplementares ).
Histoquímica / Coloração com azul alciano
Fragmentos retirados da periferia do supraoccipital do MOR 548 foram escolhidos para otimizar as chances de obter principalmente cartilagem, em vez de osso. As amostras de emu também incluíram cartilagem calcificada da sinondrose supraoccipital-exoccipital, bem como algum osso subjacente.Estes fragmentos do ema existente foram fixados com NBF a 10% durante a noite e depois desmineralizados em EDTA 500 mM (ácido etilenodiaminotetraacético dissódico) (pH 8,0) até todo o mineral ser removido, e novamente sujeitos à fixação como acima. Devido à natureza frágil dos tecidos fósseis desmineralizados, as amostras MOR 548 foram incorporadas em ágar a 3% (Becton Dickinson Cat # 214530) para estabilizar os tecidos antes do corte. Os tecidos existentes e os tecidos embebidos em ágar do MOR 548 foram então submetidos a preparação de rotina para histologia de parafina, embebidos em parafina, cortados em um micrótomo a 5 mícrons e corados com azul alciano ( Métodos Complementares ).
Imunofluorescência / Imuno-histoquímica
Os fragmentos fósseis foram incorporados primeiro em ágar a 3% (Becton Dickinson Cat # 214530), depois desmineralizados em EDTA (0,5 M, pH 8,0) por duas semanas, lavados com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) e preparados para incorporação e corte análises ( métodos complementares ). Em um laboratório separado, os tecidos de cartilagem foram amostrados de um fragmento de crânio de emu seco (MOR-OST 1800), fixado por uma hora à temperatura ambiente em 10% de NBF ( Métodos Complementares ).As seções (200 nm) foram cortadas em um ultramicrótomo Leica EM UC6 e expostas a um anticorpo primário de colágeno anti-galinha de coelho tipo II (Abcam ab21290) ( Métodos Complementares ). Para anticorpos criados contra o colágeno aviário I, usamos o anticorpo US Biological C7510–13B. As seções também foram incubadas apenas em tampão de diluição de anticorpo, ao qual nenhum anticorpo primário foi adicionado, para controlar a ligação espúria do anticorpo secundário ( Fig. 2 Complementar ).
Isolamento de condrócitos e coloração com DAPI / PI
Os fragmentos foram desmineralizados em EDTA (0,5 M, pH 8,0) por pelo menos 2 semanas com alterações diárias. Os detritos resultantes após a desmineralização foram coletados do fundo dos poços e centrifugados por 2 min a 400 rcf. Após a remoção do sobrenadante, os sedimentos foram ressuspensos em 1x PBS para remover o restante EDTA e o processo foi repetido três vezes. Após a centrifugação final, os grânulos foram incubados com a solução de quido de ferro piridoxal isonicotinoil-hidrazona (PIH) (10 mM de PIH em 50 mM de NaOH [ 50 ]) durante a noite à temperatura ambiente, depois lavados com 1 × PBS e centrifugados para formar pellets de células, usados para coloração com DAPI / PI ( métodos suplementares ).As camadas de cartilagem do emu foram excisadas da sincrondose supraoccipital-exoccipital de um emu jovem (mas era necessária mais cartilagem para que a cartilagem femoral também fosse excisada), incubadas em 0,1% de azida de sódio por 1,5 horas e depois cortadas em fatias de 0,5–1 mm com um estéril lâmina de barbear. As fatias foram digeridas com 3 mg / mL de colagenase tipo II (Worthington CLS-2) em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) pH 7,2 com 0,1% de azida de sódio a 37 ° C durante a noite ou até que a maioria da matriz da cartilagem estivesse removido. As amostras foram centrifugadas a 300 rcf por 5 min para granular as células. As células foram ressuspensas em NBF a 10% (pH 7,2-7,4) à temperatura ambiente por 30 minutos para fixação, depois centrifugadas como antes e lavadas duas vezes com PBS. As células foram sedimentadas e sujeitas a coloração com DAPI / PI ( Métodos Complementares ).
Reconhecimentos
Agradecemos a Zhonghe Zhou por discussões e comentários proveitosos. Agradecemos a John Scannella, o MOR, o Gabriel Lab para Paleontologia Celular e Molecular, Ellen-Thérèse Lamm, Karen Chin e Allison Gentry pela ajuda de laboratório; Don Collins (Montana Emu Ranch) por doar ema cadavérico; Elena Schroeter e Dana Rashid para discussões; e Mikhail Kovalenko (Universidade do Missouri) para imagens de slides inteiros.FINANCIAMENTO
Este trabalho foi financiado pelo subsídio INSPIRE da National Science Foundation (Divisão de Ciências da Terra) (EAR-1344198 para MHS e WZ); Franklin M. e Susan Packard Orr; Vance e Gail Mullis (para MHS e WZ); Gerry Ohrstrom (para AMB e JRH); a bolsa de estudos de visita de curto prazo da Associação Americana de Anatomistas (para AMB); a Iniciativa Internacional de Bolsas de Estudo do Presidente da Academia Chinesa de Ciências (CAS-PIFI) (para AMB) e a concessão NSF-IOS (Divisão de Sistemas Organizacionais Integrativos) (1457319 para CMH e AMB).CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
AMB, MHS projetou o estudo; AMB, WZ realizou experimentos e coletou os dados; AMB, BKH, MHS analisaram dados celulares; todos os autores analisaram e interpretaram alguns resultados; JRH projetou o estudo paleohistológico original; JRH, MHS contribuiu com materiais / reagentes e espaço de laboratório; AMB, MHS escreveu o manuscrito; AMB, MHS, WZ escreveu os materiais suplementares ; JRH, BKH, CMH comentaram o manuscrito.Declaração de conflito de interesses . Nenhum declarado.
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© The Author (s) 2020. Publicado por Oxford University Press em nome de China Science Publishing & Media Ltd.
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