Novo método permite editar o genoma do parasita causador da doença de Chagas

26 de janeiro de 2017

Pesquisa conduzida na Unicamp estuda a função de proteínas envolvidas na sinalização por íons de cálcio no Trypanosoma cruzi e pode ajudar a identificar alvos para o desenvolvimento de fármacos (Imagem: Noelia Lander)

Karina Toledo | Agência FAPESP – Técnicas que permitem manipular o genoma de parasitas causadores de doenças – para, por exemplo, inibir a expressão de proteínas e investigar sua função – têm sido amplamente empregadas pelos cientistas na tentativa de identificar alvos para o desenvolvimento de fármacos.

Enquanto avanços têm sido alcançados no estudo do Trypanosoma brucei (causador da doença do sono) ou do Toxoplasma gondii (causador da toxoplasmose), por exemplo, no caso do Trypanosoma cruzi (causador da doença de Chagas) os métodos tradicionalmente usados para nocautear genes ou marcar proteínas intracelulares vêm se revelando ineficazes.

Com apoio da FAPESP, por meio do Projeto Temático “Sinalização por íons de cálcio em tripanosomatídeos”, um grupo coordenado pelo professor Roberto Docampo na Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (FCM-Unicamp) mostrou ser possível manipular o genoma do T. cruzi por meio do chamado sistema CRISPR/Cas9 (do inglês, clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated gene 9).

Docampo é professor da Universidade da Georgia, nos Estados Unidos, e mantém colaboração com o professor da Unicamp Aníbal Vercesi há mais de 25 anos, quando descobriram no T. cruzi uma nova organela chamada acidocalcisoma, que está envolvida na regulação dos níveis de cálcio dentro da célula. Ele coordena o Temático no âmbito do Programa São Paulo Excellence Chair (SPEC), desenvolvido no laboratório de Vercesi na Unicamp.

A metodologia CRISPR/Cas9 consiste em transfectar ( introduzir intencionalmente ácido nucleicos nas células) o parasita com um vetor – no caso uma pequena molécula circular de DNA chamada plasmídeo – de modo a induzir a expressão de duas outras moléculas: a enzima Cas9 e o sgRNA, que irão se unir no núcleo celular para formar uma ribonucleoproteína. A Cas9 é uma endonuclease, ou seja, uma proteína capaz de produzir uma quebra na dupla fita de DNA. O sgRNA é uma espécie de RNA-guia, que serve para dirigir essa enzima para o gene-alvo. Dessa forma, é possível introduzir ou suprimir material genético no local onde o DNA foi quebrado. Além do plasmídeo, também é transfectada uma molécula de DNA doadora que permite o reparo da dupla fita.
“Esse processo foi inicialmente descrito como sendo um sistema imune rudimentar de bactérias e, mais tarde, foi adaptado para a edição do genoma em organismos eucariotos. Atualmente, é possível usá-lo em praticamente qualquer tipo de organismo”, contou Noelia Lander, pós-doutoranda na FCM-Unicamp.

Em uma pesquisa divulgada na revista mBio em 2015, o grupo da Unicamp mostrou, pela primeira vez, ser possível usar o sistema CRISPR/Cas9 para nocautear genes do T. cruzi.
Mais recentemente, em artigo publicado no The Journal of Biological Chemistry (JBC), a equipe validou o método também para a marcação de proteínas – processo que permite estabelecer sua localização no interior das células e identificar vias de sinalização importantes para a sobrevivência do parasita.

“Fizemos o que se chama de marcação C-terminal de proteínas, que consiste em acrescentar à cadeia polipeptídica uma pequena molécula, como a hemaglutinina (HA), contra a qual já existem anticorpos comerciais específicos. Os anticorpos reconhecem a molécula, ligam-se a ela e, por meio de microscopia de fluorescência, é possível localizar a proteína que estamos estudando na célula”, explicou Lander.
Inicialmente, para confirmar se a técnica de fato funcionava com o T. cruzi, o grupo usou o sistema CRISPR/Cas9 para marcar a proteína TcVP1 (pirofosfatase vacuolar de prótons), cuja localização já era conhecida.

“Ela está presente no acidocalcisoma. Já existem anticorpos específicos contra essa proteína TcVP1 e eles apontaram para a mesma localização que a observada quando usamos o método CRISPR/Cas9”, contou Lander.

Em seguida, o sistema CRISPR/Cas9 foi usado para marcar e localizar três outras proteínas: a TcFCaBP (proteína flagelar de união ao cálcio), encontrada no flagelo do parasita; a TcMCU (uniporter de cálcio mitocondrial), que foi identificada na mitocôndria; e a TcIP₃R (receptor de inositol trifosfato), cuja localização foi confirmada no acidocalcisoma.
“Em relação à TcIP₃R, havia uma disputa no meio acadêmico sobre qual seria a localização correta. Um grupo do Japão coordenado por Katsuhiko Mikoshiba defendia a teoria de que ela estava no retículo endoplasmático, enquanto Docampo dizia estar no acidocalcisoma, o que conseguimos confirmar”, disse Lander.

Desdobramentos

Segundo a pesquisadora da Unicamp, além de pôr fim a um antigo embate, a descoberta tem diversas outras implicações, pois facilita a compreensão dos processos de sinalização celular mediados pelo cálcio no parasita.

“A sinalização por cálcio é importante para a sobrevivência do parasita e interfere no seu potencial de infectar o hospedeiro. Sinais de cálcio têm sido descritos como importantes para o processo de invasão celular”, explicou Lander.

Atualmente, o grupo tem usado o sistema CRISPR/Cas9 para estudar a função das proteínas TcMCU e TcIP₃R e, assim, confirmar se a via de sinalização por cálcio pode ser usada como alvo terapêutico no T. cruzi.

“O que fazemos basicamente é nocautear o gene que codifica a proteína ou induzir sua superexpressão. Em seguida, fazemos a caracterização fenotípica dessas linhagens mutantes”, explicou.

Parte dos experimentos do Projeto Temático está sendo feita durante os pós-doutorados de Lander e de Miguel Angel Chiurillo Siervo – ambos bolsistas da FAPESP.
“Ao estudar a função de diversas proteínas envolvidas na sinalização por cálcio, nosso objetivo é identificar uma enzima ou rota metabólica que seja essencial para o parasita e, ao mesmo tempo, não esteja presente em humanos. Assim, poderemos validá-la como alvo terapêutico”, disse Lander.
O artigo “CRISPR/Cas9-Induced Disruption of Paraflagellar Rod Protein 1 and 2 Genes in Trypanosoma cruzi Reveals Their Role in Flagellar Attachment” pode ser lido em http://mbio.asm.org/content/6/4/e01012-15.abstract.
Para acessar o artigo “CRISPR/Cas9-mediated endogenous C-terminal tagging of Trypanosoma cruzi genes reveals the acidocalcisome localization of the inositol-1,4,5-trisphosphate receptor” clique no endereço http://www.jbc.org/content/early/2016/10/28/jbc.M116.749655.full.pdf.

Toxoplasmose

Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal               A toxoplasmose é uma infecção parasitária causada pelo protozoário Toxoplasma gondii. Essa zoonose ocorre em várias partes do mundo e pode acometer aves, répteis, anfíbios e mamíferos, incluindo-se o homem. Nem todos os indivíduos infectados desenvolvem a doença. A maioria das infecções é assintomática. No homem a doença pode ser considerada rara. Embora exista apenas uma espécie desse protozoário parasitando as diferentes espécies animais, cepas isoladas apresentam comportamentos diferentes com relação à virulência e formação de cistos. O ciclo desse parasita é complexo. De modo simplificado, pode-se dizer que necessita de dois tipos de hospedeiros: definitivo e intermediário. Os hospedeiros definitivos são os felídeos, principalmente os gatos, nos quais esse protozoário realiza dois tipos de reprodução. A reprodução assexuada origina taquizoítos livres, com multiplicação rápida, observados na fase aguda da doença, e bradizoítos contidos em cistos, com multiplicação lenta, detectados na fase crônica da infecção. A reprodução sexuada ocorre no epitélio do intestino delgado, produzindo oocistos que são eliminados junto com as fezes. O gato é o único hospedeiro definitivo urbano. Outros felídeos são responsáveis por manter o ciclo em áreas silvestres. Os hospedeiros intermediários, nos quais o parasita realiza somente a reprodução assexuada, são todos os outros animais, domésticos ou silvestres, e o homem. Nestes hospedeiros encontramos somente as formas de bradizoítos, dentro de cistos, ou taquizoítos livres. Os cistos podem estar presentes em vários tipos de tecidos e órgãos, e os taquizoítos já foram detectados em sangue, sêmen, leite e urina de animais com infecção aguda. A infecção pode determinar quadros variados, desde a ausência de sintomatologia até o desenvolvimento da doença com manifestações graves, dependendo da imunidade do indivíduo. Má nutrição, estresse, doenças imunossupressoras e transplantes podem agravar a evolução dessa parasitose. Modos de infecção Em geral, o modo de infecção mais comum é por via oral, por ingestão de carne crua ou mal cozida, contendo cistos do protozoário, ou de água e frutas ou vegetais crus, contaminados com oocistos de T. gondii. Outra importante via de infecção é a intra-uterina, denominada transmissão vertical, quando o parasita passa da mãe para o feto durante a gestação. Na literatura citam-se também outros modos de infecção de menor grau de incidência, como a ingestão de leite não pasteurizado, transfusão sanguínea e transplante de órgãos. Fatores relacionados com hábitos de higiene, alimentares e culturais, além da ocupação profissional e do clima, têm influência direta na prevalência da toxoplasmose em determinadas regiões. Gato Os gatos infectam-se ao serem alimentados com carne crua ou mal cozida ou ao caçarem roedores ou pássaros que contenham cistos ou taquizoítos de T. gondii. Também podem se infectar se ingerirem oocistos do parasita, presentes no ambiente. O gato começa a eliminar oocistos junto com as fezes de três a dez dias após a ingestão de tecido contendo cistos do protozoário. Os oocistos são eliminados não esporulados, isto é, não infectantes. Os oocistos tornam-se infectantes no ambiente somente depois de um a cinco dias, dependendo da temperatura e da umidade. A excreção dos oocistos pode durar, em média, entre uma a duas ou três semanas, após a primeira exposição do gato ao parasita. Depois desse período, o gato não elimina oocistos novamente, pois desenvolve imunidade contra o protozoário. Com relação a esse fato, há na literatura relatos de resultados de experimentos que indicam a possibilidade de o gato voltar a eliminar oocistos em condições especiais. Os oocistos são muito resistentes e podem permanecer viáveis no ambiente durante meses, principalmente pelo hábito desses felinos defecarem e enterrarem suas fezes em terra fofa ou areia. Normalmente os gatos não apresentam sintomas de infecção pelo T. gondii. Porém, se estiverem com alguma doença imunossupressora, podem desenvolver a toxoplasmose com a seguinte sintomatologia: febre, diarréia, pneumonia, hepatite, inflamação ocular, doenças neurológicas, etc. A simples observação da presença de oocistos em exame de fezes não é suficiente para se afirmar que o animal está infectado, pois existem outros protozoários, parasitas de gatos, que apresentam oocistos com morfologia e tamanho muito semelhantes ao de T. gondii. O diagnóstico da infecção no gato deve ser feito por exames sorológicos que detectam a presença de anticorpos antitoxoplasma. O Médico Veterinário, com os resultados destes testes, saberá se o animal tem uma infecção recente ou não e poderá orientar quanto à necessidade de tratamento do felino ou de medidas de prevenção para seus proprietários. Humanos Inquéritos sorológicos realizados em vários países, incluindo o Brasil, apontaram altas prevalências de pessoas com anticorpos antitoxoplasma. Na maioria, 80% a 90%, com imunidade normal, a infecção passou despercebida, pois sequer apresentaram sintomatologia. Em pessoas imunocompetentes, a toxoplasmose pode ser confundida com a gripe comum, sendo os sintomas mais freqüentes: mal estar, dor de cabeça, dor muscular, febre e gânglios aumentados, popularmente denominados de ínguas. Sintomas mais graves da infecção seriam os relacionados aos problemas oculares, que podem variar de uma simples inflamação até a perda da visão. Em pessoas com a imunidade comprometida pode haver uma reativação da infecção que estava latente, determinando uma doença muito mais agressiva. Isso ocorre com portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, AIDS. Nesses indivíduos, os cistos se rompem e há a liberação dos bradizoítos, comprometendo órgãos vitais como cérebro, pulmões e coração. Outro aspecto relevante da toxoplasmose é a forma congênita. A ocorrência durante a gestação pode causar: abortamento, nascimento de prematuro, crescimento intra-uterino retardado, morte fetal e malformações severas. Entre as malformações estão: hidrocefalias, calcificações cerebrais, retinocoroidite, hepatoesplenomegalias e retardo mental. A toxoplasmose integra a rotina sorológica que o Médico solicita no pré-natal, para saber se a paciente já teve a infecção e se isso foi recente. Exames sorológicos específicos detectam dois tipos de anticorpos, IgG e IgM. A combinação dos resultados deles é que irá traçar o perfil sorológico da paciente, diferenciando uma infecção recente de uma crônica. Uma mulher que está com a imunidade normal e que já teve contato com o T. gondii, em período bem anterior à gravidez, não corre o risco de passar a doença para o feto. Por outro lado, mulheres grávidas e HIV positivas ou imunocomprometidas podem apresentar uma reativação de infecção latente. No primeiro trimestre de gestação a probabilidade de transmissão de T. gondii para o feto é menor, mas as conseqüências são mais graves. O risco de transmissão aumenta com o tempo de gestação, mas diminui a gravidade da doença para o feto. Outros animais Desde que foi descrito, em 1908, o T. gondii tem sido detectado em várias espécies animais, diretamente por meio de isolamentos em animais de laboratório ou indiretamente por provas sorológicas. Algumas pesquisas também revelaram que determinadas espécies hospedeiras são mais resistentes geneticamente do que outras, e que a patogenicidade das cepas isoladas também pode variar. A toxoplasmose pode determinar perdas econômicas devido a problemas reprodutivos como abortos, natimortos, fetos mumificados e repetição de cio. Os sinais clínicos variam e estão relacionados também com a imunidade do animal. Na epidemiologia da toxoplasmose destaca-se a importância dos portadores assintomáticos entre as espécies de animais domésticos que servem como fonte de alimento para o homem. Estudos revelaram a presença do parasita em bovinos, caprinos, suínos, ovinos, frango, pato, peru, coelho, entre outros. A ingestão de carne crua ou mal cozida desses animais pode causar a infecção no homem. O leite não pasteurizado seria outra fonte de infecção, pois o protozoário já foi isolado a partir de leite de cabra com toxoplasmose. Tratamento A toxoplasmose pode ser tratada tanto em humanos quanto em animais e, com a utilização de medicamentos, receitados pelo profissional competente, é possível evitar a progressão da doença. A necessidade e o tempo de tratamento são indicados levando em consideração o estado imune do indivíduo e os órgãos afetados. Prevenção • Ingerir somente carne bem cozida; • Lavar bem as frutas e os vegetais; • Ingerir somente leite pasteurizado; • Lavar bem as mãos e utensílios após manipular carne crua; • Usar luvas para praticar jardinagem; • Cobrir o tanque de areia onde as crianças brincam; • Alimentar gatos com ração industrializada; • Não fornecer carne crua ao seu gato; • Lavar diariamente a caixa de areia do gato e dispensar corretamente as fezes (colocar em sacos plásticos e dispensar junto com o lixo doméstico ou então dispensar diretamente no vaso sanitário); • Evitar que seu gato se alimente com insetos, roedores e pássaros; • Manter seu gato em casa; • Evitar a presença de gatos estranhos; • Manter a higiene nos diversos ambientes das propriedades rurais, evitando-se, principalmente, a presença de gatos. Bibliografia consultada Dubey, J.P.; Beattie, C.P. Toxoplasmosis of animals and man. Boca Raton: CRC Press, 1988. 220p. Spósito Filha, E.; Amaral, V. do; Santos, S.M.; Macruz, R.; Rebouças, M.M. Toxoplasma gondii em caprinos: isolamento de cepas a partir de diafragmas de animais oriundos do Estado da Bahia e abatidos em matadouros de São Paulo – Brasil. O Biológico, São Paulo, v.49, n.8, p.199-206, 1983. Spósito Filha, E.; Amaral, V. do; Macruz. R; Barci, L.A.G.; Rebouças, M.M.; Santos, S.M.; Rinald, C.A.S. Toxoplasma gondii em bovinos: evidenciação do parasita a partir de retina e diafragma de animais abatidos em matadouros do Estado de São Paulo – Brasil. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v.55, n.1, p.43-47, 1988. Spósito Filha, E.; Amaral, V. do; Macruz. R.; Rebouças, M.M.; Santos, S.M.; Drumond, L.S. Toxoplasma gondii em ovinos: isolamento do parasita a partir de diafragmas de animais procedentes do Estado do Rio Grande do Sul e abatidos em matadouros de São Paulo para consumo humano. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.1, n.2, p.117-119, 1992

Dinâmica da infecção

24/08/2011

Por Fábio de Castro
Agência FAPESP – O fator de transformação de crescimento beta (TGF-β, na sigla em inglês) tem sido relacionado à patogênese de diversas doenças, incluindo as infecções oportunistas causadas pelo complexo Mycobacterium avium , que afetam pessoas com o sistema imune comprometido, como os pacientes de Aids.

No entanto, o mecanismo pelo qual o TGF-β controla a replicação das bactérias do complexo Mycobacterium avium é mais intrincado do que se imaginava, de acordo com um estudo realizado por um grupo de pesquisadores da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).
O trabalho, publicado na revista PLoS One, foi parte da pesquisa de doutorado de Carolina L’Abbate, orientada por Joel Machado Junior e Celia Regina Whitaker Carneiro, respectivamente professores do Departamento de Ciências Biológicas e do Departamento de Microbiologia, Imunobiologia e Parasitologia da Unifesp.

O estudo foi feito no âmbito do Projeto Temático “Micobactérias de importância médica no Brasil: caracterização molecular, interação com o meio ambiente e com macrófagos”, apoiado pela FAPESP, coordenado por Sylvia Luisa Pincherle Cardoso Leão e que teve Carneiro entre seus pesquisadores principais. Além deles, o artigo teve participação de Elizabeth Cristina Pérez-Hurtado e Ivone Cipriano.
De acordo com Machado Junior, ao desvendar o importante mecanismo de controle do TGF-β sobre a replicação das bactérias do complexo Mycobacterium avium, o trabalho ajuda a “compreender como funcionam as armas do inimigo”.
“O estudo traz novas perspectivas para a compreensão da influência do TGF-β sobre a resposta do hospedeiro. Quanto melhor entendermos os mecanismos pelos quais essas bactérias subvertem a resposta do hospedeiro, mais abrimos perspectivas para o design de intervenções terapêuticas mais eficazes no tratamento dessas infecções”, disse Machado à Agência FAPESP.

Segundo ele, vários patógenos que infectam macrófagos, como a Toxoplasma gondii, Leishmania amazonensis, Trypanossoma cruzi e as bactérias do complexo Mycobacterium avium, desenvolveram mecanismos capazes de induzir a produção do TGF-β, que é uma citocina – grupo de moléculas envolvidas na emissão de sinais entre as células durante o desencadeamento das respostas imunes.
“Acreditava-se que a função do TGF-β estava associada apenas à sua capacidade imunossupressora sobre a atividade dos macrófagos, permitindo a proliferação dos patógenos dentro da célula. No entanto, neste estudo mostramos que o mecanismo é mais complexo e os efeitos dessa citocina não são tão diretos”, disse.
O estudo mostrou que os efeitos do TGF-β dependem fortemente da sua amplitude de ação. A citocina coordena a magnitude e a duração da ativação de uma quinase – enzimas que catalisam as reações de fosforilação de proteínas –, a ERK1/2, e dessa forma controla a replicação da bactéria. “Os efeitos dependem da quantidade da citocina presente no macrófago infectado e de quais vias de sinalização ela está coordenando na célula infectada”, disse Machado.
A literatura, segundo ele, já indicava que os macrófagos infectados passavam a produzir maior quantidade da citocina e, com isso, favorecia o crescimento da bactéria dentro da célula. Os cientistas da Unifesp utilizaram um modelo de macrófagos diferenciados pela citocina IL-4, que produzem de forma endógena grandes quantidades de TGF-β, mantendo altos os níveis de atividade de ERK1/2.
“Mas no modelo o efeito era o contrário: a ação do TGF-β sobre o ERK1/2 inibia a replicação da bactéria no interior da célula. Isso sugeria que esse mecanismo pode ser uma estratégia para manter a replicação intracelular de patógenos sobre controle”, explicou.

Arsenal dinâmico

As vias de sinalização intracelular são importantes componentes dos sistemas biológicos, que permitem que as células alterem seu comportamento em função de mudanças ambientais como a infecção.
“Essas vias convertem os sinais externos e geram respostas apropriadas para as mudanças do ambiente externo. Essas respostas incluem mudanças na regulação de processos metabólicos e expressão gênica. Tudo isso é determinado pela amplitude e pelo tipo do sinal que é gerado pelos estímulos. O TGF-β, portanto, funcionaria como um arsenal dinâmico no controle adicional de patógenos”, disse Machado.
O artigo TGF-β-Mediated Sustained ERK1/2 Activity Promotes the Inhibition of Intracellular Growth of Mycobacterium avium in Epithelioid Cells Surrogates (doi:10.1371/journal.pone.0021465), de Carolina L’Abbate e outros, pode ser lido em www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0021465.