Pesquisadores caracterizam substâncias produzidas por cianobactérias aquáticas

16 de janeiro de 2017

Toxinas podem contaminar peixes e frutos do mar, mas pesquisadores também avaliam potenciais aplicações farmacológicas de substâncias não tóxicas (foto: floração no Reservatório de Salto Grande, Americana (SP)/divulgação)

 

Diego Freire  |  Agência FAPESP – Boa parte das cianobactérias, conhecidas como algas azuis, vive em águas marinhas, de lagos e de rios, em contato direto com peixes e frutos do mar que podem ser afetados de diferentes formas pelas substâncias produzidas por esses microrganismos, muitas delas ainda desconhecidas. Pesquisadores da Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF) da Universidade de São Paulo (USP), em parceria com a Universidade Técnica da Dinamarca, descobriram e caracterizaram uma série dessas substâncias, produzidas por cianobactérias coletadas em um reservatório em Pernambuco e em folhas de árvores do Parque Estadual da Serra do Mar, no litoral paulista.

As descobertas foram feitas durante a pesquisa "Metabólitos secundários produzidos por microrganismos aquáticos e impacto na qualidade de frutos do mar e de peixes de água doce", realizada com o apoio da FAPESP em cooperação com o Innovation Fund Denmark. O objetivo, de acordo com os pesquisadores, é ampliar o conhecimento sobre a eventual toxicidade dessas substâncias e sobre os riscos de contaminação para consumidores de frutos do mar e peixes. No estudo também são analisadas outras classes de produtos naturais bioativos não tóxicos com potencial para diversas aplicações – entre elas, em medicamentos.

“As cianobactérias são os organismos mais antigos da Terra, bem adaptadas a qualquer ambiente com um mínimo de água. O acúmulo de fósforo, nitrogênio e matéria orgânica em ambientes aquáticos favorece o seu desenvolvimento. Esse crescimento acelerado, fenômeno conhecido como floração, que é facilmente percebido por tornar a água verde, favorece a liberação de substâncias, cujos efeitos em outros organismos não são plenamente conhecidos. Algumas espécies de cianobactérias produzem toxinas que já foram caracterizadas e outros compostos ativos que ainda não foram descobertos”, conta Ernani Pinto, professor da FCF-USP, responsável pela pesquisa.

Dessa forma, o trabalho contempla não só toxinas, mas outras substâncias produzidas pelos microrganismos que podem ter impacto na água, nos frutos do mar e nos peixes.

Entre as substâncias identificadas e caracterizadas pelos pesquisadores quatro são produzidas por uma espécie de cianobactéria coletada do Reservatório de Tapacurá, no município pernambucano de São Lourenço da Mata. O grupo já havia comprovado que a espécie estudada produz a molécula da anatoxina-a(s), toxina com efeito inibidor da colinesterase, inativando a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE), uma das mais importantes e necessárias ao pleno funcionamento do sistema nervoso de humanos, de outros vertebrados e de insetos.

Trata-se do único composto organofosforado natural conhecido. Testes de laboratório mostraram que o efeito da anatoxina-a(s) é igual ao dos inseticidas sintéticos. Sua ingestão pelo animal aquático ou pelo ser humano pode provocar salivação intensa, parada respiratória e parada cardíaca.

Agora, os pesquisadores trabalham para identificar os possíveis efeitos das novas substâncias em diferentes modelos, avaliando sua toxicidade e seus mecanismos de ação. De acordo com Pinto, o que se sabe por ora é que as substâncias são peptídeos inibidores de proteases – enzimas capazes de degradar proteínas.
“Além da produção da anatoxina-a(s), encontramos na mesma cepa quatro substâncias que são inibidoras de protease. Essa sucessão de descobertas em torno da cianobactéria indica que se trata de um organismo de extrema importância, evidenciando sua capacidade de produzir substâncias ativas dos mais variados tipos. A literatura mundial costuma se ater mais aos aspectos toxicológicos, mas essas outras substâncias descobertas podem virar medicamentos, por exemplo.”

Em outra frente da pesquisa, em parceria com o Centro de Energia Nuclear na Agricultura (Cena) da USP, o grupo encontrou 38 peptídeos produzidos por cianobactérias que vivem na água retida pelas folhas de plantas da Floresta Tropical de Picinguaba, na Serra do Mar – 37 deles inéditos na literatura científica. As substâncias não parecem ser toxinas, mas pertencem a famílias distintas de peptídeos que ocorrem em cianobactérias e que são inibidores de proteases.

“Ainda não foram realizados ensaios toxicológicos para determinar se essas substâncias são tóxicas ou não, mas elas podem cumprir uma função importante na natureza, como na alelopatia – processo que envolve metabólitos secundários produzidos por plantas, algas, bactérias e fungos que influenciam na comunicação intra e entre espécies, no crescimento e desenvolvimento de sistemas biológicos. É a capacidade que as plantas têm de produzir substâncias químicas que, liberadas no ambiente de outras, influenciam de forma favorável ou desfavorável o seu desenvolvimento”, explica Pinto.

Ainda de acordo com o pesquisador, essas substâncias podem ser produzidas para proteger as cianobactérias de animais que consomem plantas. Elas também atuam na homeostase, processo de autorregulação por meio do qual sistemas biológicos tendem a manter sua estabilidade para se ajustar a condições ótimas de sobrevivência.

“O Captopril, fármaco usado no tratamento de hipertensão arterial e em casos de insuficiência cardíaca, foi descoberto e desenvolvido a partir de uma toxina natural inibidora da enzima conversora da angiotensina I. Podemos estar no caminho do desenvolvimento de novos fármacos a partir da descoberta de novas substâncias com mecanismos semelhantes”, diz.

Os resultados foram relatados no artigo Structural Characterization of New Peptide Variants Produced by Cyanobacteria from the Brazilian Atlantic Coastal Forest Using Liquid Chromatography Coupled to Quadrupole Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometry, publicado pela revista Marine Drug. Já a descoberta das substâncias produzidas pela cianobactéria coletada no Reservatório de Tapacurá foi relatada na revista Toxicon, no artigo First report of spumigin production by the toxic Sphaerospermopsis torques-reginae cyanobacterium.

Cientistas vasculham venenos em busca de novos fármacos

02/03/2012

Por Fábio de Castro
Agência FAPESP – As toxinas produzidas por animais venenosos contêm compostos que podem ser aproveitados no desenvolvimento de uma ampla gama de fármacos e inseticidas. Mas, para que isso seja possível, é preciso identificar compostos de interesse, desvendar suas estruturas moleculares, realizar a síntese das moléculas em laboratório e, por fim, realizar testes clínicos.

 

Projeto Temático ligado ao programa BIOTA-FAPESP elucida a estrutura molecular de centenas de toxinas produzidas por aranhas, vespas e outros artrópodes (Nephila clavipes/Wikipedia)

Durante quatro anos, um grupo de pesquisadores se dedicou à identificação e elucidação da estrutura molecular de cerca de 200 peptídeos e proteínas, além de 140 pequenas moléculas encontradas no veneno de diferentes grupos de aranhas, vespas e outros artrópodes venenosos do Brasil.
Realizado no âmbito do programa BIOTA-FAPESP, o Projeto Temático "Procura de compostos líderes para o desenvolvimento racional de novos fármacos e pesticidas a partir da bioprospecção da fauna de artrópodes brasileiros", financiado pela FAPESP, foi coordenado por Mario Sergio Palma, professor do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (Unesp), em Rio Claro (SP).
De acordo com Palma, além de prospectar novas moléculas, os cientistas envolvidos com o projeto aprofundaram estudos dos mecanismos de ação das toxinas e ganharam experiência com novas técnicas de síntese de peptídeos e de pequenas moléculas.

“Além dos resultados de pesquisa extremamente positivos, o projeto possibilitou a montagem de uma unidade de síntese de peptídeos, produziu 10 teses de doutorado, 13 dissertações de mestrado e teve a participação de seis pós-doutorandos e 14 bolsistas de iniciação científica”, disse à Agência FAPESP.
Segundo Palma, que é químico de formação, o trabalhou realizado pelo grupo, por ser essencialmente multidisciplinar, exigiu o constante estabelecimento de parcerias com pesquisadores de áreas como fisiologia e farmacologia. Embora envolvesse apenas dois grupos permanentes – da Unesp em Rio Claro e Rio Preto –, com quatro pesquisadores seniores, o grupo criou tentáculos em diversas áreas e instituições.
“Toda a infraestrutura gerada pelo Temático – que permitiu o aprimoramento de técnicas de análise de estrutura e espectrometria de massas – gerou a consolidação dos nossos laboratórios. Durante os quatro anos do projeto, pesquisadores de 63 instituições diferentes utilizaram nossas instalações, multiplicando as publicações relacionadas ao nosso trabalho”, afirmou.
O Projeto Temático teve dois focos principais: as macromoléculas de biopeptídeos e proteínas – que têm interesse para aplicações na indústria química e farmacêutica – e as pequenas moléculas. A equipe se dividiu entre os dois focos e trabalhou com artrópodes venenosos de diferentes grupos, incluindo aranhas, vespas, abelhas e formigas.
“Fomos procurar, fundamentalmente, drogas que têm ação neurotóxica. Quando se compreende a estrutura e a ação dessas substâncias, com uma pequena modificação é possível fazer com que elas tenham ação neuroprotetora”, explicou Palma.
No decorrer da evolução, a estrutura das toxinas evoluiu para se adaptar à estrutura das células dos animais que deveriam ser atacados, ou dos quais era preciso se defender. Assim, em geral, para compreender a ação da toxina, é preciso não apenas desvendar sua composição, mas entender todo o contexto no qual ela atua.
“Trabalhamos, por exemplo, com dois tipos de aranhas: as construtoras de teias aéreas e as errantes – que vivem no solo e caçam. A composição dos venenos de cada uma delas é muito diferente, já que são utilizados com finalidades e estratégias distintas”, disse Palma.
As toxinas das aranhas que vivem longe do chão têm poucas proteínas e peptídeos, mas são cheias de pequenas moléculas orgânicas muito parecidas com as toxinas das plantas. As aranhas do gênero Nephila, que fazem grandes teias amareladas e douradas, foram o primeiro alvo dos estudos.
“As gotículas viscosas na teia das Nephila servem para prender pequenos insetos e também para lubrificar e favorecer a flexibilidade da teia. São compostas de um conjunto de vesículas feitas de lipídios por fora e preenchidas com toxinas”, disse.
Os cientistas estudaram como esses lipídios reagem com o exoesqueleto dos insetos presos pelo visgo, removendo a cera que o protege e colocando-o em contato com as neurotoxinas, paralisando o animal.
“Essas substâncias são inseticidas poderosíssimos. Encontramos ali moléculas interessantes, que são alcaloides retirados pelas aranhas de suas presas, que por sua vez os sequestram dos alcaloides das plantas. Uma vez que a aranha obtém o alcaloide, ela introduz modificações em sua estrutura, produzindo as neurotoxinas”, explicou Palma.
Essas aranhas só consomem proteína fresca, por isso não matam as presas. É preciso injetar nos insetos um veneno paralisante, guardando-o para os momentos de fome. Além disso, a aranha produz toxinas diferentes de acordo com o período do ano, sempre de forma coerente com o tipo de presa disponível.
“Observamos que as toxinas usadas para provocar a paralisia produzem muitas estruturas químicas diferentes. Nesse grupo de aranhas, elucidamos a estrutura de 106 moléculas”, contou o coordenador do projeto.
Três das toxinas descobertas, que causam paralisia transitória, mostraram-se especialmente interessantes quando testadas no sistema nervoso de ratos e camundongos.
“Usamos modelos de epilepsia e descobrimos que essas três drogas têm efeitos antiepiléticos promissores. Um trabalho sobre isso foi publicado na revista Brain Research”, disse Palma.
O modelo se mostrou tão promissor que o grupo estabeleceu uma parceria com o professor Jaderson da Costa, da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUC-RS), para testá-lo em modelos in vitro de tecido de cérebros humanos com epilepsia refratária.

Doenças neurodegenerativas
Os aspectos evolucionários convergentes entre plantas e aranhas também foram estudados nas chamadas aranhas coloniais, como a Parawixia bistriata, que fazem teias em plantas do gênero Banisteriopsis. Diferentemente das Nephila, que têm teias perenes, essas outras produzem as teias e as destroem diariamente.
“Encontramos um grande volume de alcaloides no veneno dessas aranhas e passamos a estudar o mecanismo de ação dessas moléculas, que provocam convulsões quando aplicadas em camundongos, ratos e coelhos. Descobrimos que o mecanismo envolve os canais de cálcio dos neurônios”, contou Palma.
Em doenças como Parkinson e Alzheimer, os neurônios degenerados têm um defeito morfológico que mantêm seus canais de cálcio abertos permanentemente, provocando uma metilação ininterrupta que causa tremores.
“O envenenamento produzido pela aranha tem um efeito muito parecido. Mapeamos o cérebro dos animais intoxicados e, com um marcador, localizamos a região onde a toxina se acumula. Verificamos que ela produz a morte do animal por excesso de íons cálcio”, afirmou Palma.
Entre o grupo das aranhas que vivem no solo, como as armadeiras, o grupo da Unesp isolou uma substância com estrutura química pouco comum na natureza. Trata-se de um composto não peptídico, não proteico, de baixa massa molecular e que aparentemente não tem toxicidade, mas atua sobre os canais iônicos.
“Testamos a substância no laboratório da PUC-RS, em ratos, e descobrimos que se trata de uma droga antiepilética ainda mais potente que a anterior. Estamos aguardando a autorização para realizar estudos em modelos humanos”, disse.
Os pesquisadores descobriram também, em vespas, uma neurotoxina capaz de paralisar e matar alguns insetos, ao agir no receptor de glutamato – uma classe de moléculas que recebem o principal neurotransmissor que estimula o cérebro.
“Há várias subfamílias e subtipos de vespas. Em um deles, descobrimos essa droga, que existe de forma modificada no sistema nervoso de mamíferos. Esse composto se mostrou um potente inibidor de crises epiléticas em modelos animais in vitro. Trabalhamos agora no processo de síntese dessa substância e estamos aguardando autorização para administrá-la em modelos animais in vivo”, disse Palma.
No veneno das vespas da espécie Polybia paulista, conhecidas como “paulistinhas”, o grupo de cientistas encontrou uma substância do grupo fenilmetilamina, semelhante a drogas utilizadas para controlar o apetite.
“A substância é um isômero estrutural de certas anfetaminas usadas para o controle do apetite e proibidas no Brasil. É parecida também com as drogas ilegais usadas em raves”, disse Palma.
No veneno de abelhas, os cientistas da Unesp descobriram grandes moléculas com notável reatividade a anticorpos da imunoglobulina. Segundo Palma, nunca se conseguiu produzir um soro para veneno de abelhas, pois o mecanismo de ação do veneno era desconhecido.
“Elucidamos a composição das proteínas do veneno e conseguimos entender todas as etapas do processo de envenenamento. A partir daí, fizemos uma parceria com a divisão de soros do Instituto Butantan e com o grupo de Imunologia do Instituto do Coração (Incor) e produzimos o soro. Temos agora a primeira patente de soro de veneno de abelha do mundo, que já foi outorgada. Estamos transferindo o know-how para a divisão de produção de soro do Butantan para planejar a produção em escala”, disse.
Na vertente do projeto voltada aos peptídeos, duas substâncias isoladas a partir de venenos de vespas tiveram destaque especial: peptídeos antibióticos e uma nova família de peptídeos muito pouco conhecida até agora, com ação potente em células pancreáticas. O trabalho foi feito em parceria com o professor Everardo Magalhães Carneiro, da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), especialista em diabetes.
“Pode ser um modelo interessante para ajudar em certos casos de diabetes que são provocados pelo fato de a glândula produtora de insulina não conseguir secretar a substância. Talvez esses peptídeos sejam adjuvantes interessantes para auxiliar a liberação natural de insulina”, afirmou Palma.

Novo método detecta rapidamente toxinas produzidas na água por bactérias

21/12/2011

Por Elton Alisson
Agência FAPESP – Em ambientes aquáticos é possível encontrar algumas espécies de bactérias que realizam fotossíntese e, por apresentarem clorofila e outros pigmentos, são comumente confundidas com microalgas.

Técnica implementada na Unesp, que utiliza espectrometria de massas, possibilita identificar compostos tóxicos diretamente nas células de cianobactérias e em reservatórios de água (divulgação)

Mas diferentemente das minúsculas algas, que possuem diversas aplicações industriais, essas bactérias, denominadas cianobactérias, produzem toxinas (microcistinas e nodularinas) altamente prejudiciais à saúde humana. Para evitar graves riscos à saúde, essas toxinas precisam ser detectadas, identificadas e quantificadas rapidamente, principalmente em reservatórios de água.
De modo a atender à demanda por esses testes no Brasil, pesquisadores do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (Unesp), em Rio Claro (SP), desenvolvem métodos rápidos e sensíveis para detecção de cianotoxinas diretamente de células de cianobactérias e de reservatórios de água por meio de espectrometria de massas.
Alguns resultados do projeto de pesquisa, realizado com apoio da FAPESP por meio do Programa Jovens Pesquisadores em Centros Emergentes, foram apresentados no 4º Congresso BrMASS, realizado pela Sociedade Brasileira de Espectrometria de Massas de 10 a 13 de dezembro em Campinas (SP).
De acordo com Humberto Márcio Santos Milagre, coordenador do projeto, um dos objetivos da pesquisa foi verificar se era possível realizar a identificação de variações das microcistinas a partir de cromatografia em camada delgada (TLC, da sigla em inglês) combinada com o método de ionização Maldi.

A técnica cromatográfica é considerada uma das mais simples e econômicas para separar e identificar visualmente os componentes de uma mistura. Entretanto, a identificação inequívoca dos compostos não é possível pelos métodos tradicionais de revelação e comparação com padrões de referência.
Em função disso, a TLC vem sendo combinada com a espectrometria de massas para realizar a identificação e elucidação estrutural de compostos de misturas complexas.
Utilizando a combinação de TLC com Maldi, os pesquisadores da Unesp conseguiram identificar e caracterizar microcistinas em padrões comerciais da bactéria e em diferentes amostras de água da represa Billings, em São Paulo, após a proliferação de cianobactérias. Com isso, conseguiram comprovar a eficácia da técnica para detecção das toxinas produzidas por elas, as cianotoxinas.
“Nossa perspectiva é utilizar a técnica para realizar análises ambientais”, disse Milagre. Após o estudo utilizando a técnica, o grupo partiu para a identificação das cianotoxinas diretamente das células de cianobactérias.
Utilizando cepas de duas bactérias produtoras da toxina, obtidas junto ao Instituto Pasteur e crescidas em biorreatores no Laboratório de Espectrometria de Massas da Unesp de Rio Claro, os pesquisadores identificaram microcistinas e nodularinas alguns dias depois de as cianobactérias permanecerem no meio de cultura.
“Essas bactérias se proliferam rapidamente em condições favoráveis e com isso produzem uma grande quantidade de metabólitos, além das microcistinas, que são dificilmente degradadas e altamente tóxicas”, disse Milagre.
Milagre lembra de uma das maiores tragédias já causadas por microcistinas no Brasil, ocorrida na cidade de Caruaru, em Pernambuco. Em 1996, 60 pacientes submetidos à hemodiálise em uma clínica na cidade nordestina morreram intoxicados pela hepatotoxina microcistina encontrada na água utilizada no procedimento médico, que foi recolhida por um caminhão-pipa de um reservatório de água contaminado pelas toxinas.

Medalha
Na abertura do 4º Congresso BrMASS, o diretor científico da FAPESP, Carlos Henrique de Brito Cruz, recebeu a medalha BrMASS por sua atuação junto à FAPESP em prol do fomento da ciência e tecnologia e da área de espectrometria de massas no Brasil.