Resumo
A estase evolutiva caracteriza linhagens que raramente se especiam e apresentam pouca mudança fenotípica ao longo de longos períodos de tempo geológico. Embora linhagens que parecem exibir estase evolutiva sejam frequentemente chamadas de fósseis vivos, acredita-se que nenhum mecanismo único seja responsável por suas baixas taxas de evolução morfológica e baixa diversidade de espécies. Algumas análises das taxas de evolução molecular em algumas linhagens de fósseis vivos indicaram que esses clados exibem baixas taxas de mudança genômica. Aqui, investigamos mecanismos de estase evolutiva usando um conjunto de dados de 1.105 éxons para 481 espécies de vertebrados. Demonstramos que dois clados antigos de peixes com nadadeiras raiadas, classicamente chamados de fósseis vivos, gars e esturjões, exibem as menores taxas de substituição molecular em genes codificadores de proteínas entre todos os vertebrados com mandíbula. Taxas de evolução comparativamente baixas são observadas em sítios degenerados quádruplos em gars e esturjões, implicando um mecanismo de estase dissociado da seleção que especulamos estar ligado a um aparato de reparo de DNA altamente eficaz. Mostramos que duas espécies de gar que compartilharam ancestralidade comum pela última vez há mais de 100 milhões de anos produzem híbridos morfologicamente intermediários e férteis na natureza. Isso torna os gars a divergência hibridizante natural mais antiga entre eucariotos e corrobora a previsão teórica de que baixas taxas de substituição de nucleotídeos no genoma retardam o acúmulo de incompatibilidades genéticas, permitindo a hibridização entre linhagens profundamente divergentes e diminuindo a taxa de especiação ao longo de escalas de tempo geológicas. Nossos resultados ajudam a estabelecer a estase molecular como uma barreira à especiação e à inovação fenotípica e fornecem um mecanismo para explicar a baixa diversidade de espécies em linhagens fósseis vivas.
Introduction
A biodiversidade é distribuída assimetricamente pela Árvore da Vida. Compreender os condutores dessa variação é um problema central na biologia evolutiva ( Darwin, 1859 ; Gavrilets & Losos, 2009 ; Schluter, 2000 ; Stanley, 1975 ). Linhagens longevas e pobres em espécies representam uma alta proporção de fenótipos e história evolutiva únicos ( Dornburg & Near, 2021 ; Stanley, 1975 ; Stein et al., 2018 ). No entanto, os fatores que contribuem para a persistência das linhagens longevas, fenotipicamente conservadoras e pobres em espécies, conhecidas como fósseis vivos, permanecem desconhecidos ( Darwin, 1859 ; Lidgard & Love, 2021 ; Stanley, 1975 ; Turner, 2019 ).
A especiação resultante do isolamento reprodutivo de populações é teoricamente uma função da taxa de mutação; populações isoladas acumularão mutações que são incompatíveis com mutações encontradas nos genomas de indivíduos de outras populações ( Coyne & Orr, 2004 ; Orr & Turelli, 2001 ). Embora as observações destaquem a importância das taxas de mutação e do potencial genômico subjacente para gerar surtos de especiação e diversificação morfológica ( Gavrilets & Losos, 2009 ; McGee et al., 2020 ; Schluter, 2000 ), mecanismos moleculares para as origens e persistência de fósseis vivos não foram observados em muitas linhagens de vida longa, pobres em espécies e morfologicamente conservadoras ( Avise et al., 1994 ; Casane & Laurenti, 2013 ; Chalopin et al., 2014 ; Hay et al., 2008 ; Selander et al., 1970 ). Estudos de linhagens fósseis vivas descobriram que elas possuem baixa ( Amemiya et al., 2013 ; Braasch et al., 2016 ; Du et al., 2020 ; Thompson et al., 2021 ; Venkatesh et al., 2014 ) a rápida ( Hay et al., 2008 ) taxas evolutivas moleculares em comparação com outros clados. Portanto, existem apenas evidências ambíguas de uma contrapartida molecular para a estase morfológica em fósseis vivos que poderia explicar suas baixas taxas de especiação.
Ray-finned fishes include several classic examples of of living fossil vertebrates (Brito et al., 2017; Darwin, 1859; Dornburg & Near, 2021; Grande, 2010; Lidgard & Love, 2021; Stanley, 1975, 1979). Gars (Lepisosteidae; Figure 1) are a clade of seven living species of ray-finned fishes (Figure 1A) that form part of the sister lineage of Teleostei, which includes over 35,000 species and represents half of all extant vertebrate diversity (Dornburg & Near, 2021; Grande, 2010).
Relações filogenéticas, distribuição geográfica e estase morfológica de gars. (A) Árvore filogenética de gars com datação por ponta baseada em três subconjuntos dos 90 maiores exons e com posições de fósseis fixadas com base em filogenias morfológicas. O círculo marca o momento da divergência entre Atractosteus e Lepisosteus em aproximadamente 105 milhões de anos atrás. MRCA = ancestral comum mais recente. A filogenia calibrada no tempo é de Brownstein et al. (2023) . (B) A estase morfológica em gars é exemplificada por espécies quase idênticas separadas por mais de 50 milhões de anos no tempo. Fotografias de fósseis de gar da Formação Green River do Eoceno são de Lance Grande, e fotografias de gars vivos são de Zachary Miller, ambas usadas com permissão.
Os gars são notáveis por sua baixa variação anatômica ( Figura 1B ) ( Grande, 2010 ). Os primeiros gars fósseis do Jurássico são quase idênticos às espécies vivas ( Brito et al., 2017 ), e membros reconhecíveis de gêneros vivos aparecem no registro fóssil já no Cretáceo médio ( Brownstein et al., 2023 ; Grande, 2010 ). Observações do registro fóssil de lepisosteídeos levaram Darwin (1859 , p. 107) a identificá-los como fósseis vivos, e o rótulo persiste desde então ( Braasch et al., 2016 ; Dornburg & Near, 2021 ; Wiley & Schultze, 1984 ).
Aqui, investigamos se existem análogos moleculares para os padrões de evolução morfológica lenta observáveis em gars e outros vertebrados fósseis vivos com mandíbulas. Vários estudos encontraram evidências de que os gars podem ter taxas mais lentas de evolução molecular do que outros peixes com nadadeiras raiadas ( Braasch et al., 2016 ; Thompson et al., 2021 ), mas comparações em larga escala não foram feitas entre vertebrados. Nem o isolamento reprodutivo incompleto através da divergência mais profunda em gars vivos ( Bohn et al., 2017 ) foi testado usando dados em escala genômica ou integrado com observações de evolução molecular em Lepisosteidae. Demonstramos que as taxas evolutivas moleculares de gars e outro clado de peixes fósseis vivos, Acipenseriformes (esturjões e peixes-espátula), são as mais baixas entre os vertebrados e estão associadas a evidências de isolamento reprodutivo incompleto através de escalas de tempo geológicas em linhagens fósseis vivas pobres em espécies. Ao confirmar a existência de híbridos férteis e morfologicamente intermediários em populações selvagens das duas linhagens gar existentes Atractosteus e Lepisosteus , que divergiram durante o Cretáceo Inferior ( Figura 1A ; Brownstein et al., 2023 ; Grande, 2010 ), relacionamos as baixas taxas de evolução molecular em gars com a produção de híbridos entre espécies com ancestralidade comum antiga (> 100 milhões de anos). Nossos resultados mostram que a viabilidade híbrida diminui amplamente com tempos de divergência parental mais antigos e maiores taxas de evolução molecular entre vertebrados com mandíbula. Consequentemente, nossas descobertas apoiam a hipótese de que baixas taxas evolutivas moleculares estão associadas à baixa diversidade de espécies e à evolução fenotípica estagnada ao longo de longos períodos de tempo geológico em linhagens fósseis vivas.
Materiais e métodos
Taxas de evolução molecular entre as principais linhagens de vertebrados com mandíbula
Para testar se taxas lentas de evolução morfológica estão associadas a baixas taxas de evolução molecular em fósseis vivos como gars, esturjões e peixes-espátula, estimamos a variação da taxa molecular em 1.105 exons de uma amostra de 478 espécies de vertebrados com mandíbula. Identificamos sequências de exons ortólogos dos genomas de 471 espécies selecionadas no banco de dados do NCBI para as seguintes linhagens principais de vertebrados com mandíbula: Acipenseriformes, Aves, Crocodylia, Chondrichthyes, Lepidosauria, Lissamphibia, Marsupialia, Placentalia, Polypteridae e Teleostei ( Figura Suplementar S1a ). O protocolo HMM disponível no HMMER 3.1 ( Wheeler & Eddy, 2013 ) foi usado para pesquisar exons ortólogos em cada um dos genomas baixados. Essas sequências de éxons foram extraídas usando scripts Python de uma análise filogenômica de peixes com nadadeiras raiadas utilizando esses loci ( Hughes et al., 2018 ). Alinhamos as sequências de éxons usando o MAFFT v.7.3 ( Katoh & Standley, 2013 ) com parâmetros padrão. Alinhamentos de éxons para as sete espécies vivas de gars (Lepisosteidae) utilizadas em um estudo filogenômico ( Brownstein et al., 2023 ) foram incluídos na análise comparativa. Cada exon foi alinhado separadamente entre as espécies em uma determinada linhagem de vertebrados, resultando em um máximo de 1.105 alinhamentos amostrados para cada linhagem. Sítios degenerados quádruplos (4D) foram extraídos de todos os exons e concatenados em todos os clados de vertebrados, exceto Polypteridae e Acipenseriformes. Isso ocorreu porque não conseguimos encontrar sequências de sítios 4D ortólogos para todos os conjuntos de genomas disponíveis para esses dois clados; seria necessário amostrar sítios 4D para todas as três espécies para amostrar os ancestrais comuns de Polypteridae e Acipenseriformes, pois só conseguimos incluir três espécies de cada em nossas análises de estimativa de taxa de exon.
Estimamos e comparamos taxas de substituição molecular posteriores em cada exon em todos os principais clados de vertebrados usando árvores de entrada fixas em análises de relógio molecular bayesiano. Usamos filogenias calibradas no tempo publicadas anteriormente para Teleostei ( Hughes et al., 2018 ), Acipenseriformes ( Kumar et al., 2017 ), Polypteridae ( Near et al., 2014 ), Lepisosteidae ( Brownstein et al., 2023 ), Chondrichthyes ( Kumar et al., 2017 ), Testudines ( Shaffer et al., 2017 ), Amphibia ( Kumar et al., 2017 ), Lepidosauria ( Pyron & Burbrink, 2014 ), Aves ( Prum et al., 2015 ), Crocodylia ( Green et al., 2014 ), Marsupialia ( Upham et al., 2019 ) e Placentalia ( Upham et al ., 2019). al., 2019 ). A árvore temporal de vertebrados usada na análise da taxa de ramificação de celacantos e peixes pulmonados foi retirada da literatura ( Wang et al., 2021 ) e timetree.org ( Kumar et al., 2017 ). Usamos essas filogenias moleculares calibradas temporalmente no BEAST 2.5.2 ( Buckaert et al., 2019 ) inserindo-as no formato Newick na aba “Árvore Inicial” no terminal BEAUTi. Os seguintes operadores foram desativados para garantir que a árvore de entrada permanecesse fixa: escalonador de árvore, escalonador de raiz de árvore, operador uniforme, deslizamento de subárvore, troca estreita e larga e Wilson-Balding. Por sua vez, não estimamos nem a topologia da árvore nem os tempos de divergência. Scripts personalizados para inserir as árvores, juntamente com arquivos xml contendo as topologias de árvore usadas, estão em Material suplementar .
BEAST 2.5.2 ( Buckaert et al., 2019 ) foi usado para estimar a taxa de substituição de nucleotídeos posteriores bayesiana para cada um dos 1.105 exons e sítios degenerados quádruplos separadamente de cada clado de vertebrados. O programa de computador BEAUTi ( Buckaert et al., 2019 ) foi usado para construir arquivos xml individuais de cada alinhamento de exon e os sítios degenerados quádruplos agrupados para cada clado com a filogenia calibrada no tempo específica do clado. A filogenia calibrada no tempo foi fixada de forma que BEAST não estimasse a topologia ou os tempos de divergência. Devido ao grande número de análises BEAST, aproveitamos o cluster de computação de alto desempenho de Yale e construímos scripts personalizados para produzir e executar arquivos xml ao longo deste pipeline. Primeiro, produzimos um xml de modelo para cada clado que especificava todos os parâmetros de entrada com referência a um único xml. Em seguida, utilizamos um script de lote personalizado ( Material Suplementar ) para ajustar as especificações fornecidas pelo arquivo XML de modelo com cada gene, a fim de produzir arquivos XML individuais para cada éxon amostrado em um clado de vertebrados específico. Utilizamos um modelo de ramificação de Yule (nascimento puro) como o prior da árvore, um modelo de relógio lognormal relaxado como o prior do relógio para permitir taxas independentes para cada ramificação e um modelo HKY de evolução de nucleotídeos para permitir frequências e taxas de transição desiguais, e executamos cada análise por 10 milhões de gerações. Após a conclusão das análises, confirmamos a mistura de MCMC suficiente (valores efetivos de tamanho de amostra > 200) para cada execução BEAST usando o programa Tracer v. 1.7 ( Rambaut et al., 2018 ) e o pacote R “coda” v.0.19-4 ( Plummer et al., 2006 ).
Para testar se nossas estimativas de taxa não foram afetadas pela escolha do modelo de árvore, reexecutamos exons em lepidossauros e teleósteos com as cinco taxas estimadas mais rápidas, as cinco mais lentas e as cinco mais intermediárias sob um modelo de árvore de nascimento-morte. Teoricamente, a escolha do modelo de árvore não deveria afetar nossos resultados, pois fixamos a árvore temporal em cada análise, mas optamos por testá-la diretamente. As escolhas de parâmetros foram, de resto, as mesmas das execuções originais. Em seguida, comparamos as estimativas absolutas de taxa entre as execuções usando os modelos de Yule e de nascimento-morte. Em seguida, testamos para verificar se o número de espécies amostradas para diferentes clados influenciava as taxas estimadas. Entre os seis clados com mais de sete espécies amostradas que apresentaram taxas médias estimadas de substituição superiores à média em gars ( Figura 2 ), subamostramos sete espécies de lepidossauros e teleósteos (o número de espécies amostradas para gars) que capturaram a ancestralidade comum dos principais subclados (ou seja, Squamata, Toxicofera, Euteleostei, Acanthomorpha) de nosso conjunto de dados de éxons e reexecutamos as análises sob a especificação do parâmetro original (ou seja, sob um modelo de Yule). Em seguida, comparamos as estimativas de taxas absolutas entre as execuções usando a amostragem completa e reduzida de lepidossauros e teleósteos ( Tabela 1 ).
As taxas de substituição genômica entre vertebrados revelam o ritmo lento da evolução molecular do gar. (A) Filogenia combinada, anotada e calibrada temporalmente de todas as 478 espécies de vertebrados incluídas na análise de estimativa da taxa de exon. Para fins de combinação das subárvores usadas em uma única figura, as datas de divergência entre os subclados analisados independentemente foram retiradas do Timetree.org. (B) Gráfico de violino e caixa mostrando as distribuições das taxas estimadas de substituição de logaritmo de exon em diferentes clados de vertebrados em relação à taxa média no gar (linha preta). (C) Taxas de substituição estimadas em sítios degenerados quádruplos em diferentes clados de vertebrados. As silhuetas são de domínio público do Phylopic.org.
Estimativa de taxas evolutivas moleculares específicas de ramos para fósseis vivos
We investigated the rates of molecular substitution in candidate living fossil lineages including paleognathous birds; the hoatzin, Opisthocomus hoazin; the tuatara, Sphenodon punctatus; the salamanderfish, Lepidogalaxias salamandroides; African coelacanth, Latimeria chalumnae; Australian lungfish, Neoceratodus forsteri; and the West African lungfish, Protopterus annectens. We extracted the estimated posterior molecular substitution rates for the corresponding terminal branches in our fixed time trees. For the two lungfishes and African Coelacanth, we constructed a time tree that included these taxa and the species of Lissamphibia for which exon data were available. We included Lissamphibians to ensure that the time tree accommodated the paraphyly of sarcopterygian “fishes.” We accomplished this by taking the fixed tree of Lissamphibia (see “Input Tree Selection”) and manually adding L. chalumnae and the clade (Dipnoi) formed by the Australian lungfish and the West African lungfish as two progressive outgroups to Amphibia (following Amemiya et al., 2013 ; Meyer et al., 2021 ; Wang et al., 2021 ) e corrigindo os tempos de divergência após buscas no TimeTree.org. As análises BEAST foram executadas usando os mesmos parâmetros das execuções de estimativa de taxa para todo o clado e extraindo taxas específicas de ramo para L. chalumnae e Dipnoi.
Hybridization among deeply divergent gar lineages Lepisosteus and Atractosteus
Em seguida, investigamos assinaturas de hibridização entre linhagens de gar profundamente divergentes para testar se taxas lentas de evolução molecular poderiam estar associadas ao isolamento reprodutivo incompleto ao longo do tempo em linhagens fósseis vivas. Para verificar regiões onde ambos os gêneros de gar existentes são atualmente simpátricos, baixamos dados de ocorrência para espécies de Lepisosteus e Atractosteus spatula do FishNet2 ( http://fishnet2.net/ ). Removemos registros errôneos e duplicados. Os arquivos de dados de ocorrência limpos estão incluídos no Material Suplementar .
Híbridos naturais foram relatados entre populações selvagens de A. spatula e Lepisosteus osseus no Texas e Oklahoma ( Bohn et al., 2017 ; Taylor et al., 2020 ), e então examinamos evidências genômicas de hibridização nessas populações. Obtivemos amostras de tecido de 206 espécimes de A. spatula , L. osseus e hipotetizamos híbridos A. spatula × L. osseus de todos os sistemas fluviais costeiros do Golfo do México ( Tabela Suplementar S1 ) para testar tanto a semelhança dos híbridos quanto a presença de F1s e F2s no sistema do rio Brazos. Visamos os sistemas Brazos e Trinity e o reservatório Choke Canyon porque estudos anteriores demonstraram de forma convincente a presença de indivíduos híbridos A. spatula × L. osseus nesta região ( Bohn et al., 2017 ; Taylor et al., 2020 ). Selecionamos um subconjunto de cinco isolados de A. spatula e sete de L. osseus com altas concentrações de DNA, com base em leituras do fluorômetro Qubit (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), para testar a ocorrência natural de híbridos entre espécies desses gêneros. Em seguida, comparamos esses isolados com amostras de tecido de indivíduos gar que apresentaram intermediação morfológica consistente com a hibridação, bem como com sua identificação em um estudo anterior ( Bohn e outros, 2017 ).
Utilizamos o sequenciamento de DNA associado ao sítio de restrição de dupla digestão (ddRADseq) para obter um amplo conjunto de dados de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) para investigar se populações simpátricas de L. osseus e A. spatula apresentam evidências de hibridização. Realizamos o ddRADseq seguindo uma versão modificada de um protocolo frequentemente utilizado ( Peterson et al., 2012 ). Detalhes adicionais estão descritos no Material Suplementar . Bibliotecas agrupadas que selecionamos por tamanho para 300–500 bps usando um BluePippin foram sequenciadas pelo University of Oregon Genomics & Cell Characterization Core Facility em um Illumina HiSeq 4000. Montamos o conjunto de dados gar ddRAD usando iPyrad v.0.9.68 ( Eaton & Overcast, 2020 ) com o genoma Lepisosteus oculatus (número de acesso NCBI: GCF_000242695.1) ( Braasch et al., 2016 ) como referência, resultando em um total de 256.750 loci compartilhados por pelo menos quatro amostras. Para análise de hibridização, os SNPs ddRAD foram filtrados usando VCFTools v.0.1.15 ( Danecek et al., 2011 ) para que apenas SNPs bialélicos com contagens de alelos menores > 1 e <5% de dados ausentes fossem retidos. Para minimizar os efeitos da ligação entre marcadores, mantivemos um SNP aleatório a cada janela de 10.000 pb, resultando em um conjunto de dados contendo 2.097 SNPs (2,2% de dados ausentes). Além disso, utilizamos um script R personalizado para identificar 1.223 SNPs (2,1% de dados ausentes) que foram fixados entre as espécies parentais ( A. espátula e L. osseus ). As leituras ddRAD Illumina demultiplexadas são depositadas no NCBI SRA (PRJNA1077910).
Avaliamos sinais genômicos de hibridização entre A. spatula e L. osseus . Primeiro, imputamos genótipos ausentes usando a função "impute" (método = "random") no pacote R LEA v.3.4.0 ( Frichot & François, 2015 ). Para examinar padrões de variação genética, então realizamos análise de componentes principais (PCA) usando os 2.097 SNPs filtrados com a função "dudi.pca" no pacote R ade4 v.2.1.4 ( Dray & Dufour, 2007 ; Thioulouse et al., 2018 ). Além disso, estimamos coeficientes de ancestralidade genômica para cada indivíduo com fatoração de matriz esparsa não negativa implementada no pacote R LEA. Executamos 10 análises replicadas com entre 2 e 10 populações ancestrais ( K ). Examinamos pontuações de entropia cruzada para determinar o valor ótimo de K ( Figura Suplementar S3a ).
Identificamos e classificamos híbridos usando o conjunto de dados de 1.223 SNPs fixos. Primeiro, usamos a função "find.clusters" do pacote R Adegenet v.2.1.4 ( Jombart & Ahmed, 2011 ) para atribuir todos os indivíduos a dois grupos genéticos realizando 10 milhões de iterações de busca do algoritmo K -means com 1.000 centróides iniciais aleatórios. Começando com as associações de grupo K -means, usamos a função "snapclust" do Adegenet ( Beugin et al., 2018 ) para estimar a probabilidade de associação às classes parentais, F1 ou de retrocruzamento. Executamos no máximo 10 milhões de gerações para 1.000 execuções replicadas da expectativa-maximização. Além disso, estimamos o índice de ancestralidade e a heterozigosidade interespecífica para cada indivíduo usando o pacote R HIest v.2.0 ( Fitzpatrick, 2012 ).
Para melhor compreender os padrões de hibridização, incluindo as proporções sexuais distorcidas entre os parentais A. spatula e L. osseus , interrogamos dados de DNA mitocondrial (mtDNA) para uma amostra de 201 gars, incluindo todas as espécies vivas em Lepisosteidae. Como o DNA mitocondrial é herdado maternalmente, inferir uma árvore filogenética usando dados de sequência mitocondrial pode esclarecer proporções sexuais distorcidas em cruzamentos híbridos. Incluímos dois espécimes de Amia calva para servir como grupos externos na análise filogenética. Os locais de amostragem dos espécimes usados para análises genéticas estão listados na Tabela Suplementar S1 . Extraímos DNA de tecidos preservados em etanol a 95% usando um kit padrão DNeasy Qiagen Blood and Tissue (QIAGEN, Valencia, CA, EUA). Para minimizar a inibição enzimática a jusante, purificamos as extrações de DNA com uma precipitação com etanol: acetato de sódio 3M (pH = 5,2) foi adicionado igual a 10% do volume total da extração de DNA, seguido por etanol 100% igual a 2,5 vezes o volume total de DNA. Após a mistura, incubamos as extrações por 10 min a -80 °C. Centrifugamos as amostras por 30 min a 8.000 RCF, despejamos cuidadosamente o sobrenadante e lavamos o pellet de DNA com 250 µl de etanol 70% frio. Centrifugamos as amostras novamente por 5 min a 8.000 RCF, despejamos o sobrenadante, deixamos o pellet secar ao ar por ~15 min e ressuspensos com a quantidade desejada de água livre de DNAse.
Inferimos uma árvore genética de mtDNA de gars ( Figura 5F ) com uma análise filogenética do gene citocromo b ( cytb ) codificado mitocondrialmente. A análise filogenética molecular incluiu 33 espécimes de A. spatula , 2 espécimes de A. tristoechus , 8 espécimes de A. tropicus , 65 espécimes de L. osseus , 5 espécimes de L. platostomus , 44 espécimes de L. oculatus , 23 espécimes de L. platyrhincus , 21 espécimes de híbridos de A. spatula × L. osseus e um único espécime de A. calva e A. sequências do ocellicauda para servir como grupos externos. Amplificamos gene cytb usando primers de PCR e condições de ciclagem publicados anteriormente ( Wright et al., 2012 ). Preparamos produtos de amplificação para sequenciamento de DNA usando precipitação com polietilenoglicol e montamos sequências contíguas de reações individuais de sequenciamento de DNA usando o programa de computador Geneious v.7.2 ( Kearse et al., 2012 ). Alinhamos novas sequências de citocinas (cytb) visualmente com aquelas geradas anteriormente em estudos iniciais da filogenia de gar ( Wright et al., 2012 ). Determinamos o esquema ideal de particionamento de dados entre as três posições de códons do gene. cytb gene and molecular evolutionary models using the Bayesian information criterion in the computer program Partitionfinder v. 2.1 (Lanfear et al., 2017). Finally, we inferred the mitochondrial gene tree from the aligned cytb sequences with the optimal molecular evolutionary models and partitioning scheme using the computer program MrBayes v. 3.2 (Ronquist et al., 2012), where posterior probabilities for the phylogeny and parameter values were estimated using Metropolis-couple Markov chain Monte Carlo (Huelsenbeck et al., 2001; Larget & Simon, 1999). The MrBayes analysis ran for 107 generations with two simultaneous runs each with four chains. We checked for convergence of the MC3 algorithm and stationarity of the chains by monitoring the average standard deviation of the split frequencies between the two runs, which was less than 0.005 after 3 × 106gerações. Além disso, plotamos a pontuação de verossimilhança e todas as estimativas de parâmetros do modelo em relação ao número de gerações para determinar quando não houve aumento em relação ao número de gerações no programa de computador Tracer v. 1.7 ( Rambaut et al., 2018 ). Descartamos os primeiros 50% das gerações amostradas como burn-in e resumimos a filogenia posterior como uma árvore de consenso de regra majoritária de 50%. Todas as sequências do gene cytb geradas para este estudo estão disponíveis no GenBank PP331004 – PP331204 .
Padrões de evolução genômica em fósseis vivos. (A) Taxas de substituição estimadas em exons em diferentes clados de vertebrados considerados fósseis vivos, mostrando que lepisosteídeos e acipenseriformes têm taxas mais lentas de evolução molecular do que outros vertebrados fósseis vivos. Gráficos de taxas de substituição de exon de ramo extraído contra porcentagem de divergência de sequência de suas espécies irmãs em nossas árvores de entrada para (B) gar de nariz longo (espécie irmã é gar de nariz curto, L. platostomus ), (C) gar de jacaré (espécie irmã é gar cubano, A. tristoechus ), (D) sterlet (espécie irmã é esturjão chinês, A. sinensis ), e (E) esturjão chinês (espécie irmã é sterlet, A. ruthenus ). Observe que não há divergência de sequência de táxons irmãos para uma grande proporção de exons amostrados em espécies individuais de gars e esturjões. As silhuetas são de domínio público do Phylopic.org.
Verificação de Atractosteus × Lepisosteus híbridos de ocorrência natural. (A) Distribuição de gars existentes (vermelho = Atractosteus spp., azul = Lepisosteus spp.), mostrando a ampla sobreposição nas áreas de distribuição de espécies de ambos os gêneros existentes. (B) Intermediação fenotípica no crânio de híbridos putativos. (C) Pontuações dos primeiros componentes principais versus heterozigosidade genômica estimada. (D) Estimativas conjuntas mais altas do índice de ancestralidade e heterozigosidade interespecífica inferidas. (E) Resultados da estrutura populacional LEA para o K = 3 ótimo, com indivíduos (colunas) coloridos por coeficientes de ancestralidade estimados. (F) Probabilidades de atribuição SNAPCLUST para classes parentais, F1 e de retrocruzamento. Nenhum indivíduo foi fortemente atribuído a qualquer classe de retrocruzamento. (C) e (E) usaram 2.097 SNPs ddRAD bialélicos; (D) e (F) utilizaram 1.223 SNPs diagnósticos bialélicos fixados diferencialmente entre A. spatula e L. osseus . Todos os conjuntos de dados apresentam <10% de genótipos ausentes por SNP.
Intermediação fenotípica de híbridos gar e mecanismos de estase genômica em gars. (A) Boxplot agrupado mostrando que gars híbridos não expandem a variância nas razões de medidas cranianas observadas em espécies gar existentes e extintas. (B) Idades da divergência de hibridização mais antiga em linhagens vertebradas selecionadas plotadas contra as taxas médias de exon estimadas para seus respectivos clados de coroa, mostrando um padrão de decaimento exponencial consistente com o ritmo de incompatibilidade híbrida previsto pela teoria. (C) Gráfico de árvores gênicas inferidas bayesianamente de inter-relações gar usando DensiTree, mostrando a ausência de classificação de linhagem incompleta entre Atractosteus - Lepisosteus . Eventos de introgressão reconstruídos na árvore gar encontrada no PhyloNet usando (D) uma e (E) seis reticulações. Duas e seis reticulações têm as maiores pontuações de log-verossimilhança associadas, mas produzem cenários improváveis. (F) Árvore genética do DNA mitocondrial inferida a partir de sequências do gene do citocromo b usando MrBayes 3.2. Os números nos nós indicam suporte posterior bayesiano e os indivíduos são identificados como híbridos de Atractosteus spatula e Lepisosteus osseus estão marcados com um círculo roxo. As fotografias dos peixes-agulha vivos são de Zachary Miller e usadas com permissão, e as fotografias do esturjão e da tartaruga são de domínio público.
Análises morfométricas geométricas de híbridos gar
Para quantificar como os fenótipos de indivíduos híbridos dos dois gêneros gar existentes se comparam aos de suas linhagens parentais, usamos um conjunto de dados amostrados de 25 espécimes de A. spatula , L. osseus e A. spatula × L. osseus do sistema do rio Brazos no Texas. O crânio e a mandíbula foram selecionados como regiões de estudo porque há variação morfológica filogeneticamente e taxonomicamente informativa nessas características entre linhagens de gars existentes e extintos ( Brito et al., 2017 ; Grande, 2010 ; Kammerer et al., 2006 ; Wiley, 1976 ), e tanto o crânio quanto a mandíbula contêm apomorfias-chave de Atractosteus e Lepisosteus ( Grande, 2010 ; Wiley, 1976 ). Isso inclui características como a orientação e o contato das sínfises dentárias e a largura do crânio, que diferem entre Lepisosteus e Atractosteus e podem parecer distintas em indivíduos híbridos. Um total de sete contagens e proporções merísticas foram medidas.
Incluímos 24 marcos morfométricos: 12 no crânio na vista dorsal e 12 na mandíbula na vista ventral ( Figura Suplementar S6 ). Os marcos foram colocados com base em bordas previamente definidas entre os principais elementos craniomandibulares ( Grande, 2010 ). Digitalizamos as coordenadas dos marcos e definimos escalas para cada crânio usando tpsUtil64 v. 1.7 e tpsDIG2 v. 2.26. Executamos análises tanto no pacote geomorph do R ( Adams & Otárola-Castillo, 2013 ) quanto no programa MorphoJ ( Klingenberg, 2011 ). Em ambos os programas, aplicamos uma superposição generalizada de Procrustes para excluir efeitos de tamanho, posicionamento e orientação antes de conduzir análises de componentes principais nos dados. Verificamos o gráfico de ajuste de Procrustes resultante para outliers e então executamos análises de componentes principais.
Avaliando a disparidade morfológica dos gars em tempo profundo
Para quantificar a variação na morfologia dos gars ao longo do tempo, coletamos dados de espécimes individuais de espécies de gars existentes e extintas, abrangendo mais de 75 milhões de anos, para comparar o formato do crânio em todo o clado da coroa dos gars. Optamos por uma comparação quantitativa dessas características nos gars da coroa, em vez da análise das taxas de evolução das características ao longo do tempo, dado o pequeno tamanho da amostra deste clado ( n = 12 espécies; Figura 1 ), e focamos em medições bidimensionais e contagens merísticas para mitigar os efeitos da compressão e deformação post-mortem dos fósseis de gars.
Nossas medições e conjunto de dados merísticos incluem todas as espécies extintas atualmente descritas, classificadas com segurança no grupo coroa-gar ( Figura 1 ), bem como uma nova amostra de cruzamentos híbridos de A. spatula × L. osseus . Os híbridos examinados incluíram uma cabeça preservada em álcool (KUI não catalogada), três peixes inteiros preservados em álcool (KUI 18407, 18408 e 18560) e três crânios esqueléticos, que também foram utilizados em nossas análises morfométricas geométricas (KUI 18558, 18409 e 18559). Esses espécimes foram coletados dos mesmos sistemas fluviais dos quais nossos dados de sequência estabelecem a presença de híbridos: o Rio Trinity, ~1,6 km ao norte da Ponte da Rota 90 dos EUA em Liberty, TX (KUI 18407), perto da foz do Rio Trinity (KUI 18560, 18558, 18559) e na foz do Rio Trinity, perto da Baía de Trinity (KUI 18408, 18409).
As medições realizadas incluíram proporções dimensionais de todos os ossos do teto do crânio do peixe-agulha, bem como comprimento padrão, comprimento da cabeça, escala da linha lateral e contagens de raios das nadadeiras. Todas as medições foram realizadas com paquímetros digitais. A amostra foi combinada com a amostra total de peixes-agulha-coroa em Grande (2010) , totalizando n = 124 espécimes, e o conjunto de dados foi analisado e plotado em R usando o ggplot2. Todas as medições e dados merísticos estão disponíveis em Material Suplementar .
Detection of introgression among living lineages of gars
Por fim, avaliamos se espécies vivas de Lepisosteidae exibem assinaturas de introgressão em escalas de tempo filogenéticas mais profundas. Primeiramente, utilizamos o MrBayes 3.2.7 ( Ronquist et al., 2012 ) para gerar árvores gênicas bayesianas para o subconjunto de 770 exons ortólogos identificados por Brownstein et al. (2023) como variantes em gars amostrados para todos os gars existentes e dois grupos externos de teleósteos ( Megalops cyprinoides e Osteoglossum bicirrhosum ). Estes representam os exons variáveis em gars amostrados para reconstruir nossa hipótese filogenômica bayesiana de data final. Utilizamos um modelo evolutivo molecular HKY + I + G implementado no programa de computador MrBayes v. 3.2 ( Ronquist et al., 2012 ), e estimamos probabilidades posteriores para a filogenia e valores de parâmetros usando Monte Carlo de cadeia de Markov de casal Metropolis ( Huelsenbeck et al., 2001 ; Larget & Simon, 1999 ). MrBayes foi executado para 1,5 × 10 6 gerações com duas execuções simultâneas, cada uma com quatro cadeias para cada exon. A convergência dos posteriores foi verificada no Tracer v. 1.7 ( Rambaut et al., 2018 ). Por fim, utilizamos o programa DensiTree ( Buckaert, 2010 ) para avaliar a concordância entre as árvores gênicas resultantes ( Figuras 1 e 4A ).
Estudos anteriores (por exemplo, Edelman et al., 2019 ; Maddison, 1997 ; Mallet et al., 2016 ) observaram que evidências de discordância topológica entre topologias de árvores gênicas podem ser reflexo tanto de ordenação de linhagem incompleta quanto de introgressão. Assim, conduzimos um teste secundário de episódios introgressivos entre Lepisosteidae usando PhyloNet 3.7.3 ( Wen et al., 2018 ). Com base nas 770 árvores gênicas geradas no Mr. Bayes 3.2.7, inferimos redes filogenéticas a partir da pseudoverossimilhança máxima com uma reticulação de zero e então comparamos a log-probabilidade das reticulações até 6 com 200 replicações para cada cenário de reticulação.
Comparação de pares de espécies hibridizantes de idades de MRCA e taxas de clado inteiro
Buscamos na literatura informações sobre as linhagens mais profundamente divergentes que ainda hibridizam para os principais clados de vertebrados analisados neste estudo ( Figura 2 ). As idades das divergências de hibridização mais antigas foram plotadas em relação às estimativas da taxa média de substituição de éxons geradas neste artigo. Esses dados estão incluídos na Tabela S2 Suplementar .
Resultados e discussão
As menores taxas de substituição em todo o genoma em vertebrados
Em contraste com as altas taxas moleculares associadas às radiações adaptativas ( Gavrilets & Losos, 2009 ; McGee et al., 2020 ; Schluter, 2000 ), não está claro se as baixas taxas de especiação e evolução fenotípica em gars e outras linhagens que se acredita estarem passando por estase evolutiva refletem uma taxa mais lenta de mudança genômica ( Braasch et al., 2016 ; Takezaki, 2018 ). Para testar isso, estimamos as taxas de substituição de nucleotídeos para 1.105 exons ortólogos ( Hughes et al., 2018 ) amostrados de 478 vertebrados ( Figura 2A ), incluindo novas sequências para todas as espécies existentes de gars.
As estimativas de taxas resultantes demonstram que os exons gar evoluem consistentemente entre 0,5 e 3 ordens de magnitude mais lentamente do que qualquer outro clado vertebrado principal ( Figuras 2B e 3 ; Tabela Suplementar S2 ). Esse padrão é consistente entre os genes, com quase todos os locus em gars exibindo as taxas mais baixas ou uma das mais baixas entre os ortólogos entre os vertebrados ( Figuras 2 e 3 ; Figuras Suplementares S1 e S6 ). As taxas lentas de gars provavelmente não são artefatos de diferentes idades de clados ou diversidade de espécies, já que tanto as linhagens mais jovens, mais ricas em espécies, quanto as mais velhas e empobrecidas em nossa análise exibem taxas médias de substituição mais altas ( Figura 2 ; Figuras Suplementares S1 – S5 ). Somente os genomas de esturjões e peixes-espátula (Acipenseriformes), tartarugas e crocodilianos se aproximam das taxas evolutivas lentas observadas em gars. As taxas de crocodilos e tartarugas também são distorcidas à direita, refletindo altas taxas de substituição para vários exons nesses clados quando comparados aos gars ( Figura 2B ).
As taxas de substituição de éxons de gar e acipenseriformes também são muito menores do que as taxas exônicas estimadas de clados mais diversos (teleósteos, lepidossauros), mesmo quando esses clados ricos em espécies são subamostrados para conter o mesmo número de espécies que os gars ( Tabela S3 Suplementar ). Finalmente, resultados de taxas semelhantes são obtidos para gars e outros clados, mesmo quando diferentes modelos de árvore (Yule vs. nascimento-morte) são usados ( Tabela 1 ), verificando que essas escolhas anteriores não afetam nossos resultados. Assim, em cada iteração de nossas análises, gars e acipenseriformes têm as menores taxas estimadas de substituição de éxons em vertebrados com mandíbulas por várias ordens de magnitude.
Results of tests using reduced sampling
| Clade name | Species count | Mean rate | Log10 mean | Ln mean | SD |
|---|---|---|---|---|---|
| Gars | 7 | 8.71E-05 | −4.06 | −9.35 | 4.97E-05 |
| Acipenseriforms | 3 | 1.90E-04 | −3.72 | −8.57 | 1.90E-04 |
| Polipterídeos | 3 | 9.03E-04 | -3,04 | -7,01 | 9.91E-04 |
| Tartarugas | 22 | 3.34E-03 | -2,48 | -5,7 | 1.37E-02 |
| Crocodilianos | 4 | 3.90E-03 | -2,41 | -5,55 | 1.50E-02 |
| Condrictes | 5 | 5.75E-03 | -2,24 | -5,16 | 1.81E-02 |
| Lissamfíbios | 5 | 7.13E-03 | -2,15 | -4,94 | 1.69E-02 |
| Teleósteos um | 7 | 7.24E-03 | -2,14 | -4,93 | 1.78E-02 |
| Marsupiais | 4 | 7.47E-03 | -2,13 | -4,9 | 1.67E-02 |
| Lepidosauros um | 7 | 7.68E-03 | -2,11 | -4,87 | 1.81E-02 |
| Lepidosauros | 36 | 1.50E-02 | -1,82 | -4,2 | 3.80E-02 |
| Placentários | 42 | 2.02E-02 | -1,69 | -3,9 | 4.85E-02 |
| Pássaros | 60 | 2.11E-02 | -1,68 | -3,86 | 4.72E-02 |
| Teleósteos | 292 | 6.34E-02 | -1,2 | -2,76 | 4.58E-02 |
um Análise de subamostragem.
As taxas genômicas de gars e acipenseriformes também são muito mais lentas do que outros fósseis vivos putativos, incluindo o tuatara, S. punctatus ; o celacanto, L. chalumnae ; peixes pulmonados; o tubarão-elefante, Callorhinchus milii ; e a cigana, O. hoazin ( Figura 3A ). Isso contrasta com estimativas anteriores de taxas evolutivas genômicas de vertebrados, que sugeriram que L. chalumnae e C. milii possuem taxas de substituição molecular comparáveis ou até mais lentas do que os peixes holostianos ( Braasch et al., 2016 ; Du et al., 2020 ; Takezaki, 2018 ; Thompson et al., 2021 ). Tais distinções podem ser resultado do menor número de espécies e genes amostrados em estudos anteriores ( Braasch et al., 2016 ; Du et al., 2020 ; Takezaki, 2018 ; Thompson et al., 2021 ). O ritmo lento da evolução genômica dos gar também contrasta com as taxas evolutivas moleculares excepcionalmente altas dos peixes teleósteos, que têm a maior taxa média dos clados de vertebrados amostrados em nosso estudo ( Figura 2B ). Essa alta taxa evolutiva foi associada ao evento de duplicação do genoma completo que ocorreu no início da história evolutiva dos teleósteos ( Brunet et al., 2006 ; Ravi & Venkatesh, 2018 ). Em contraste, os polipterídeos, a linhagem irmã de todos os outros peixes com nadadeiras raiadas e potenciais fósseis vivos ( Near et al., 2014 ), mostram taxas de substituição em todo o genoma semelhantes à maioria dos outros clados de vertebrados ( Figura 2B ).
A evolução molecular é tão lenta em gars e acipenseriformes que espécies irmãs com tempos de ancestralidade comum superiores a 20 milhões de anos ( Figura 1A ; Brownstein et al., 2023 ; Luo et al., 2019 ) não mostram diferenças de nucleotídeos em uma proporção apreciável de exons amostrados; isso é visível em boxplots mostrando uma distribuição multimodal de taxas de exons em ramos terminais que levam a espécies gar individuais ( Figura 3B–E ; Figura Suplementar S3 , veja também Figura Suplementar S7 ). Essas baixas taxas de evolução genômica em gars e acipenseriformes ( Figuras 2B e 3B–E ) validam baixas taxas de evolução de elementos transponíveis e proteômica relatadas em espécies de ambas as linhagens ( Braasch et al., 2016 ; Du et al., 2020 ), bem como evidências que sugerem taxas de substituição mais lentas em Holostei (gars e bowfin, A. calva ) em relação a outros vertebrados ( Takezaki, 2018 ; Thompson et al., 2021 ). A baixa taxa de evolução em esturjões está presente apesar das principais mudanças estruturais no genoma, incluindo duplicações de genoma inteiro, que ocorreram neste clado ( Você et al., 2020 ).
Também estimamos taxas de substituição em sítios quádruplos degenerados (4D) para cada clado de vertebrados. Acredita-se que sítios quádruplos degenerados sejam protegidos da seleção porque cada mutação nesses sítios é uma substituição sinônima que não altera o aminoácido traduzido ( Li, 1993 ). As diferenças nas taxas de alterações em sítios 4D entre linhagens de vertebrados foram amplamente comparáveis às taxas de substituição estimadas para todas as alterações nos exons ( Figura 2C ; Figura Suplementar S6 ), com gars exibindo taxas muito mais lentas do que todos os outros vertebrados, exceto crocodilianos ( Figura 2C ). Isso demonstra que as taxas genômicas de gar são consistentemente estagnadas entre os tipos de substituições de nucleotídeos que estão sob vários graus de pressão seletiva, estabelecendo um padrão de taxa semelhante entre sítios seletivamente restritos e neutros nos genomas de vertebrados.
Para cada clado, exceto gars, as estimativas da taxa de substituição do sítio 4D foram consistentemente menores do que as estimativas médias da taxa de substituição exônica ( Figura 2 ). Isso é surpreendente, considerando que os sítios 4D devem estar sob seleção relaxada em relação a outros sítios exônicos. No entanto, os sítios 4D demonstraram estar sob seleção devido ao viés do uso de códons, o que poderia diminuir sua taxa de substituição ( Chamary & Hurst, 2004 ). Além disso, nosso método para estimar as taxas de substituição para sítios 4D não é diretamente comparável à abordagem que usamos para estimar as taxas de substituição exônica. As taxas de substituição exônica foram estimadas independentemente para cada exon. No entanto, qualquer exon dado continha apenas alguns sítios 4D, então analisamos um conjunto de dados concatenados de todos os sítios 4D para cada clado. Assim, nossa descoberta de taxas de substituição mais baixas para sítios 4D versus todos os sítios exônicos pode ser o produto tanto da biologia quanto da metodologia. Independentemente disso, em ambos os conjuntos de dados, observamos o mesmo padrão onde os gars têm a menor taxa estimada de evolução molecular. Baixas taxas de evolução molecular observadas em exons e sítios 4D em gars, juntamente com estudos anteriores de elementos transponíveis ( Braasch et al., 2016 ) e rearranjos de ordem genética ( Thompson et al., 2021 ) demonstram que baixas taxas evolutivas são encontradas em todo o genoma desses antigos peixes com nadadeiras raiadas.
As divergências de hibridização mais antigas em eucariotos
Uma indicação de que taxas evolutivas moleculares lentas estão associadas à baixa diversidade de espécies em linhagens fósseis vivas é a geração de híbridos de espécies com tempos de divergência antigos. Isso inclui cruzamentos artificiais de A. spatula com L. osseus e do peixe-espátula Polyodon spathula com o esturjão russo Acipenser gueldenstaedtii ( Herrington et al., 2008 ; Káldy et al., 2020 ). Análises de relógio relaxado estimam 105 milhões de anos como o tempo de divergência entre Atractosteus e Lepisosteus ( Figura 1A ; Brownstein et al., 2023 ). Apesar desse antigo tempo de divergência, há relatos de que o gar-jacaré hibridiza com o gar-de-nariz-longo e o gar-pintado ( L. oculatus ) nos sistemas dos rios Brazos, Trinity e Red, no reservatório Choke Canyon (rio Frio) e na baía de Aransas no Texas e Oklahoma, EUA ( Bohn et al., 2017 ; Taylor et al., 2020 ).
Para entender os padrões de hibridização através das divergências mesozóicas em gars, reunimos um conjunto de dados de SNPs usando ddRADseq. A ACP do nosso conjunto de dados de 1.223 SNPs mostra que espécimes suspeitos de A. spatula × L. osseus formam um aglomerado compacto no meio do primeiro eixo do componente principal que distingue os genótipos dos indivíduos das espécies parentais ( Figura 4C , Figuras Suplementares S8–S11 ). Gars híbridos mostram heterozigosidade marcadamente alta em relação aos indivíduos das espécies parentais ( Figura 4C ). As análises de classificação híbrida identificam com confiança esses indivíduos como híbridos F1 de ocorrência natural entre populações simpátricas de A. spatula e L. osseus ( Figura 4C–F ; Figura Suplementar S15 ). Também identificamos um retrocruzamento entre híbridos e A. spatula , confirmando que alguns híbridos F1 são férteis ( Figura 4D–F ).
A análise morfométrica geométrica tanto da forma craniana quanto da mandibular descobriu que os híbridos consistentemente se agrupam como intermediários entre o gar-jacaré e o gar-de-nariz-longo ( Figura 4B ; Figuras Suplementares S12–14 ). Assim, os padrões de intermediação morfológica encontrados em híbridos de linhagens que compartilham ancestralidade comum muito mais jovem ( Zou et al., 2007 ) são recapitulados nos aspectos da anatomia do gar que variam entre o gar-jacaré e o gar-de-nariz-longo ( Grande, 2010 ). Como a hibridização é um importante impulsionador da inovação fenotípica ( Arnold & Hodges, 1995 ; Seehausen, 2004 ), a intermediação dos híbridos de gar-jacaré e gar-de-nariz-longo ( Figura 4B ) e a sobreposição entre a morfologia desses híbridos e outras espécies de gar abrangendo 100 milhões de anos ( Figura 5A ; Brownstein et al., 2023 ) ilustram uma barreira potencial à produção de novos fenótipos neste clado.
A probabilidade de hibridização viável diminui exponencialmente com a divergência em animais ( Bolnick & Near, 2005 ; Coyne & Orr, 2004 ; Edmands, 2002 ; Matute et al., 2010 ), e a hibridização extensiva na natureza entre espécies com um tempo tão antigo de ancestralidade comum é atualmente desconhecida para qualquer outra linhagem de vertebrados. Nossos resultados demonstram que as idades de divergências capazes de hibridizar declinam precipitadamente com o aumento da taxa evolutiva molecular, sugerindo que o modelo de "acumulação em bola de neve" de incompatibilidades genéticas ao longo do tempo se mantém entre os vertebrados ( Figura 5B ). Antes deste estudo, as linhagens divergentes mais antigas conhecidas por hibridizar na natureza são espécies de samambaias Cystopteris e Gymnocarpium , que compartilharam ancestralidade comum pela última vez há aproximadamente 58 milhões de anos ( Rothfels et al., 2015 ). Por sua vez, a existência de híbridos e retrocruzamentos estabelece Atractosteus e Lepisosteus como os eucariotos naturalmente hibridizantes mais profundamente divergentes ( Figura Suplementar S16 ).
Introgressão em tempo profundo e limites de espécies em gars
A hibridização natural entre Atractosteus e Lepisosteus está associada a taxas de substituição de nucleotídeos estagnadas ( Figura 2B e C ), o que pode explicar baixas taxas de diversificação de linhagem ( Figura 1A ) e mudança fenotípica mínima ao longo de mais de 100 milhões de anos em gars ( Clarke et al., 2016 ; Grande, 2010 ; Rabosky et al., 2013 ). Uma possibilidade é que episódios consistentes de hibridização entre linhagens simpátricas e divergentes de gars tenham divergência genética e fenotípica limitada neste clado. Dado que Atractosteus e Lepisosteus viveram em simpatria na América do Norte desde o Paleoceno ( Grande, 2010 ), testamos se os genomas gar mostram assinaturas de introgressão histórica. Primeiro, avaliamos a presença de classificação de linhagem incompleta entre espécies gar existentes examinando a discordância entre árvores genéticas representando os 770 exons variáveis amostrados para este clado. Observamos uma classificação de linhagem incompleta limitada dentro de Lepisosteus , mas nenhum padrão de discordância entre espécies de Atractosteus e Lepisosteus sugestivos de introgressão entre esses clados ( Figura 5C ; Figura Suplementar S17 ). Em segundo lugar, conduzimos análises de rede filogenética ( Wen et al., 2018 ) para avaliar a presença de evolução reticulada em gars. Essas análises não resolveram episódios claros de evolução reticulada entre linhagens de Atractosteus e Lepisosteus , mas resultaram em cenários espúrios que sugeriram introgressão entre Holostei e Teleostei. Em terceiro lugar, reconstruímos uma árvore genética mitocondrial de n = 199 gars existentes, que resolveram inequivocamente Atractosteus e Lepisosteus como linhagens separadas ( Figura 5 ; Figura Suplementar S18 ). Embora tenham coexistido por mais de 55 milhões de anos na América do Norte ( Grande, 2010 ), a hibridização não promoveu um fluxo gênico generalizado entre espécies de Atractosteus e Lepisosteus ( Figura 5D e C ).
Apesar de sua capacidade de hibridizar, não há sinais de introgressão antiga em gars. Em vez disso, barreiras ao fluxo gênico entre espécies de Lepisosteus e Atractosteus podem resultar de diferenças comportamentais e de história de vida entre esses clados ( Echelle & Grande, 2014 ). Para investigar essa possibilidade, analisamos se os híbridos A. spatula × L. osseus se resolvem exclusivamente dentro de uma das linhagens parentais em uma árvore genética mitocondrial. Todos os híbridos amostrados possuem de A. spatula DNA mitocondrial ( Figura 5F ), indicando que A. spatula é o genitor materno de todos os híbridos selvagens genotipados. Isso sugere que a assimetria na viabilidade híbrida em gars pode estar relacionada ao sexo da espécie parental ( Turelli & Moyle, 2007 ). Embora as diferenças nas taxas relativas de evolução nuclear e mitocondrial em L. osseus e A. spatula ( Bolnick et al., 2008 ; Moran et al., 2021 ) possam resultar na assimetria observada, não há diferença detectável nas taxas de substituição genômica dessas espécies ( Figura 3A–C ) ou os comprimentos dos ramos que subtendem espécimes dessas espécies na árvore genética do DNA mitocondrial ( Figura 5F ). A assimetria não é atribuível a um maior grau de infertilidade nas espécies com cromossomos específicos do sexo ( Turelli, 1998 ), já que os gars e seu gênero irmão vivo Amia não possuem um sexo heterogamético ( Thompson et al., 2021 ). Não há indicação de incompatibilidades genômicas associadas ao sexo das espécies parentais em gars hibridizantes porque cruzamentos artificiais de A. spatula macho e L. osseus fêmea produziram descendentes viáveis ( Herrington et al., 2008 ). Em vez disso, a assimetria híbrida dos gars pode ser atribuível à fecundidade significativamente maior de A. spatula em relação a Lepisosteus ( Smith et al., 2020 ) ou ao compartilhamento forçado do habitat de desova durante anos sem inundação de planícies de inundação em sistemas fluviais habitados por ambas as linhagens. Essas observações ilustram que a divergência entre Atractosteus e Lepisosteus foi mantida por fatores ecológicos e comportamentais sutis e sugerem explicações para o maior número de híbridos F1 do que F2 ou retrocruzamentos de regiões onde Atractosteus e Lepisosteus existem em simpatria.
Mecanismos genômicos de estase evolutiva
O que é responsável pelas taxas de substituição genômica excepcionalmente baixas e pelos padrões interligados de isolamento reprodutivo incompleto, baixa diversidade de espécies e evolução fenotípica estagnada em peixes-agulha? Nossos resultados, que mostram que taxas comparativamente lentas de evolução molecular estão presentes tanto em sítios seletivamente restritos quanto neutros nos exons desses peixes ( Figuras 2B , C e 3 ), implicam um mecanismo de estase evolutiva independente de causas extrínsecas, como a ausência de competição ecológica ( Darwin, 1859 ; Stanley, 1975 ). Essas taxas evolutivas extraordinariamente lentas também não são atribuíveis ao fluxo gênico contínuo entre populações simpátricas de peixes-agulha com isolamento reprodutivo incompleto. Em vez disso, as evidências favorecem processos moleculares subjacentes à estase, talvez associados a mecanismos de reparo de DNA. Trabalhos recentes sugerem que os esturjões possuem mecanismos de reparo de DNA altamente eficazes ( Gazo et al., 2021 ). Isso pode ser atribuído à atividade diferencial de genes como xpc ( Gazo et al., 2021). ), que faz parte do mecanismo de reparo de nucleotídeo único em vertebrados ( Kusakabe et al., 2019 ; Puumalainen et al., 2016 ). Especulamos que mecanismos de reparo de DNA podem funcionar para promover baixas taxas de substituição de nucleotídeos em todo o genoma em peixes-agulha e esturjões, embora trabalhos futuros sejam necessários para demonstrar isso completamente.
Taxas evolutivas excepcionalmente lentas fornecem um mecanismo para a estagnação evolutiva
A presença de características intrínsecas responsáveis pela estase evolutiva prolongada e a existência de fósseis vivos são ambas controversas ( Casane & Laurenti, 2013 ; Eldredge et al., 2005 ; Lidgard & Love, 2018 ; Schopf, 1984 ). Uma crítica primária é a falta de uma explicação para o acoplamento de baixas taxas de diversificação de linhagem e mudança fenotípica em clados que se acredita exibirem estase. De fato, nossas análises confirmam que linhagens fósseis vivas clássicas, como celacantos e rincocéfalos, têm taxas de evolução molecular semelhantes à maioria dos outros clados de vertebrados ( Chalopin et al., 2014 ; Gemmell et al., 2020 ) ( Figura 3A , Figura Suplementar S2 ), correspondendo à sua maior disparidade fenotípica antiga ( Friedman & Coates, 2006 ; Herrera-Flores et al., 2017 ) e contrastando com estimativas anteriores de taxas de evolução genômica nesses clados com base em menos espécies e loci amostrados.
Nossos resultados validam a previsão teórica de que taxas de substituição genômica excepcionalmente lentas em gars e acipenseriformes atuam como um mecanismo para isolamento reprodutivo incompleto, permitindo que linhagens profundamente divergentes produzam híbridos viáveis e férteis. Isso se encaixa na hipótese nula do modelo de especiação de Dobzhansky-Muller ( Coyne & Orr, 2004 ): baixas taxas de mutação estão associadas ao isolamento reprodutivo incompleto em gars ao longo de mais de 100 milhões de anos. Não encontramos taxas genômicas extremamente lentas em outros vertebrados previamente caracterizados como fósseis vivos, como celacantos, peixes-pulmonados e tuatara ( Figura 2A ), sugerindo que fatores extrínsecos como ecologias estáveis ou isolamento em ilhas podem desempenhar um papel na persistência dessas linhagens antigas. No entanto, nossos resultados mostram que o fluxo gênico contínuo entre espécies profundamente divergentes, baixa diversidade de espécies e baixa disparidade morfológica estão pareados com baixas taxas de evolução genômica em vários grandes grupos antigos de peixes. Com a identificação da relação entre taxas extraordinariamente baixas de mudança genômica e estase evolutiva nesses antigos peixes fósseis vivos, o trabalho pode começar a avaliar se os mecanismos de reparo de danos ao DNA e edição de incompatibilidade de nucleotídeos estão por trás da estase dramática nessas linhagens que se estende por centenas de milhões de anos no tempo evolutivo.
Conclusões
A estase evolutiva, um fenômeno no qual uma linhagem gera pouca diversidade fenotípica ou de espécies ao longo do tempo, pode explicar por que alguns ramos da Árvore da Vida são muito menos ricos em espécies e morfologicamente díspares do que outros. No entanto, ainda não foi estabelecido com segurança se as taxas moleculares de evolução são mais lentas em linhagens fósseis vivas. Aqui, usando uma amostra de 1.105 éxons, mostramos que várias linhagens fósseis vivas clássicas, entre elas os gars (Lepisosteidae) e os esturjões e peixes-espátula (Acipenseriformes), possuem taxas de substituição genômica excepcionalmente baixas. Ao analisar dados de SNP, mitocondriais e morfométricos geométricos, confirmamos que os gêneros gar que compartilharam ancestralidade comum pela última vez no Cretáceo Inferior hibridizam naturalmente. Incrivelmente, alguns híbridos parecem ser férteis, o que implica que as barreiras ao fluxo gênico não se manifestaram nos gars, apesar de um tempo até a ancestralidade comum exceder 100 milhões de anos. Juntos, esses dados sugerem que taxas lentas de evolução morfológica e especiação estão associadas a baixas taxas de substituição molecular, o que pode facilitar a hibridização em divergências profundas ao reduzir o acúmulo de incompatibilidades genéticas.
Material suplementar
Material suplementar está disponível on-line em Evolution .
Disponibilidade de dados
Todos os dados gerados estão no manuscrito, nos Materiais Suplementares ou no Repositório Dryad associado a este artigo: https://doi.org/10.5061/dryad.15dv41p2q .
Contribuições dos autores
O CDB coletou os dados, conduziu as análises e redigiu e editou o artigo com a colaboração dos demais autores. DJM e TJN coletaram os dados, conduziram as análises e editaram os rascunhos do artigo. DMK conduziu as análises. LY coletou os dados e conduziu as análises. OO, SRD e BK coletaram os dados.
Financiamento
O CDB recebeu apoio do Prêmio miniARTs da Sociedade de Biólogos Sistemáticos e do Programa de Estágios do Museu Peabody de Yale. O LY recebeu apoio do Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (Subvenção nº XDB31000000), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32170480, 31972866), da Associação de Promoção da Inovação Juvenil da Academia Chinesa de Ciências, da Academia Chinesa de Ciências ( http://www.yicas.cn ), do Programa de Cultivo de Jovens Talentos de Alto Nível da Província de Hubei e da Filial de Wuhan, Centro de Supercomputação, da Academia Chinesa de Ciências, China. O TJN recebeu apoio do Fundo Oceanográfico Bingham do Museu Peabody de Yale.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Agradecimentos
Agradecemos a Andrew Bentley por fornecer fotografias de alta qualidade de delicados crânios de gar para uso nas análises morfométricas geométricas e acesso às coleções do Museu de História Natural da Universidade do Kansas, da Universidade da Flórida e a Matt Thomas por fornecer fotografias de alta qualidade de espécies existentes, a Lance Grande por fornecer mapas de lagos antigos e fotografias de espécimes de gar do Green River, aos membros dos laboratórios Near, Muñoz e Donoghue da Yale E&EB por discussões e feedback, e a Greg Watkins-Colwell pelo acesso às coleções. Dan Daugherty (Texas Parks & Wildlife) forneceu amostras de gar do Texas e facilitou a aquisição de amostras de gar. O CDB agradece a Spencer Lott pela ajuda com um problema de codificação relacionado à subamostragem de táxons. As silhuetas de crocodilo, esturjão, tartaruga, tubarão, polipterídeo, anfíbio, marsupial e teleósteo usadas ao longo do artigo são de domínio público do Phylopic.org.
Referências
Notas do autor
CDB e DJM são coautores.
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