Descoberto o primeiro inseto sul-americano que emite luz azul

18 de setembro de 2019

André Julião  |  Agência FAPESP – Pesquisadores brasileiros descobriram em uma reserva da Mata Atlântica uma larva de mosquito capaz de emitir luz azul – algo inédito na América do Sul. Embora diferentes insetos e fungos bioluminescentes sejam conhecidos no continente, todos emitem luz nas cores verde, amarelo ou vermelho. A nova espécie, nomeada Neoceroplatus betaryiensis, foi descrita na revista Scientific Reports.

Larva de mosquito encontrada no município paulista de Iporanga tem propriedades bioluminescentes somente observadas em espécies da América do Norte, Ásia e Nova Zelândia; estudo abre caminho para novas aplicações biotecnológicas (foto: Henrique Domingos / IPBio)

 

“Essa larva foi encontrada durante uma coleta de cogumelos bioluminescentes e chamou a atenção por emitir luz azul. Fungos e vagalumes não emitem essa cor de luz, então só podia ser um novo organismo”, disse à Agência FAPESP Cassius Stevani, professor do Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP) e coordenador do trabalho.

A pesquisa integra o Projeto Temático “Quimiexcitação eletrônica em sistemas biológicos: bioluminescência e 'foto'química no escuro”, coordenado por Etelvino José Henriques Bechara, professor do IQ-USP.

Segundo Stevani, espécies emissoras de luz azul só haviam sido identificadas na América do Norte, Nova Zelândia e Ásia. A larva bioluminescente foi encontrada na Reserva Betary, área particular de Mata Atlântica localizada no município de Iporanga e vizinha ao Parque Estadual Turístico do Alto Ribeira (Petar), no sul do Estado de São Paulo.

Participaram da expedição de coleta o biólogo Isaias Santos e o norte-americano Grant Johnson, bolsista de treinamento técnico da FAPESP. Ambos trabalham no Instituto de Pesquisas da Biodiversidade (IPBio), organização que administra a Reserva Betary e realiza atividades de turismo, educação ambiental e pesquisa na propriedade, que abriga boa parte das espécies de cogumelos bioluminescentes do mundo.

A descrição do novo inseto bioluminescente foi realizada pela entomóloga Rafaela Falaschi, que atualmente realiza estágio de pós-doutorado na Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG). O nome N. betaryiensis foi escolhido em referência à reserva Betary.

Diferenças no padrão de luz

De acordo com Stevani, os indivíduos adultos da espécie não emitem luz, apenas as larvas, que vivem escondidas em troncos e são dotadas de três lanternas – uma na cauda e outras duas próximas aos olhos.

Dentre os exemplares coletados, porém, os pesquisadores encontraram um que emitia luz de vários pontos ao longo do corpo. A larva foi levada ao laboratório, tornou-se uma pupa (também bioluminescente), mas, em vez de dar origem a um mosquito como seria esperado, dela saiu uma vespa.

Os pesquisadores concluíram que a vespa também pertence a uma nova espécie da família Ichneumonidae, conhecida por depositar os ovos dentro de larvas de outros insetos, que acabam gerando vespas adultas. Ainda não se sabe, porém, se o padrão diferente de luz observado na larva ocorreu devido à infecção causada pela vespa, se corresponde a uma espécie nova de mosquito ou se estaria relacionado com o dimorfismo sexual da N. betaryiensis, ou seja, com características morfológicas que diferenciam fêmeas e machos.

Novo sistema

Além da importância para o conhecimento da biodiversidade, a descoberta da espécie emissora de luz azul – bastante rara entre esses organismos – traz a possibilidade de se desvendar um novo sistema de bioluminescência, que poderia dar origem a novas aplicações analíticas ou biotecnológicas, como marcação de células ou genes específicos em estudos biológicos ou biossensores de poluição, por exemplo.

Como todo ser bioluminescente, a nova espécie gera luz a partir da reação de um substrato – a luciferina – e uma enzima que a catalisa – a luciferase. Para realizar a separação dos dois compostos, os pesquisadores fazem um extrato dos animais e o separam em duas porções.

Uma continua conservada em gelo, com todas as enzimas preservadas (luciferase), enquanto a outra é aquecida, de forma que as enzimas sejam eliminadas e só fique o substrato (luciferina).

Para começar a caracterizar o sistema bioluminescente da N. betaryiensis, os pesquisadores do grupo de Vadim Viviani, professor da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), em Sorocaba, usaram como ferramenta a luciferina e a luciferase purificadas em seu laboratório a partir de outra espécie com capacidade de emitir luz azul, a Orfelia fultoni, que vive nos Montes Apalaches, nos Estados Unidos e Canadá.

“Graças ao fato de termos a luciferase e a luciferina da O. fultoni já purificadas em nosso laboratório, conseguimos realizar as reações cruzadas com a nova espécie. Em todas as combinações houve emissão de luz. Além disso, mostramos que a larva do mosquito também tem uma proteína que estoca luciferina, chamada anteriormente de SBF (sigla para Substrate Binding Fraction), assim como a O. fultoni. Portanto, ambas as espécies compartilham do mesmo sistema bioquímico”, disse Viviani, que lidera o grupo de pesquisa Bioluminescência e Biofotônica, do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Próximos passos

Em 2000, Viviani e os pesquisadores Thérèse Wilson e J. Woodland Hastings realizaram a primeira caracterização do sistema bioluminescente de O. fultoni, durante seu pós-doutorado na Harvard University. Desde então, o pesquisador vem realizando a caracterização bioquímica da luciferina e da luciferase desses mosquitos.

Viviani coordena o Projeto Temático “Bioluminescência de Artrópodes”, financiado pela FAPESP. Recentemente, seu grupo descobriu uma espécie do gênero Neoditomyia em cavernas do parque Intervales, no sul do Estado de São Paulo, que também possui luciferina e a sua proteína de ligação (SBF), mas não emite luz. Quando seu substrato foi misturado com a luciferase de O. fultoni, assim como da nova espécie, no entanto, gerou luz azul (leia mais em: agencia.fapesp.br/28840).

Também do ponto de vista genético, análises mostraram que a nova espécie é próxima da Neoditomyia e de O. fultoni.

Baseados no conhecimento existente sobre as outras espécies, os pesquisadores planejam agora isolar e investigar a luciferase e a luciferina da N. betaryiensis, mais rara e não tão facilmente encontrada como a espécie norte-americana.

“Já dispomos da luciferase e da luciferina da O. fultoni norte-americana e da espécie Neoditomyia de Intervales purificadas e parcialmente caracterizadas em nosso laboratório na UFSCar, o que propiciou a realização deste estudo inicial e facilitará também o isolamento da luciferina e a clonagem da luciferase de Neoceroplatus no futuro”, disse Viviani.

Uma vez isoladas, as substâncias serão clonadas e sua estrutura determinada. A da luciferase, pelo grupo da UFSCar, e a da luciferina, pelo de Stevani no IQ-USP.

“Já temos a fórmula molecular da luciferina. Sabemos quantos átomos de carbono, hidrogênio, nitrogênio, oxigênio, enxofre e outros elementos ela tem. Mas não sabemos como esses átomos estão ligados. Precisamos fazer experimentos como de ressonância magnética nuclear para elucidar a estrutura, o que espero que aconteça em breve”, disse Stevani, que coordenou um projeto de pesquisa sobre cogumelos bioluminescentes financiado pela FAPESP (leia mais em: revistapesquisa.fapesp.br/2018/12/05/brilho-construido).

O artigo Neoceroplatus betaryiensis nov. sp. (Diptera: Keroplatidae) is the first record of a bioluminescent fungus-gnat in South America (doi: 10.1038/s41598-019-47753-w), de Rafaela L. Falaschi, Danilo T . Amaral, Isaias Santos, Adão H. R. Domingos, Grant A. Johnson, Ana G. S. Martins, Imran B. Viroomal, Sérgio L. Pompéia, Jeremy D. Mirza, Anderson G. Oliveira, Etelvino J. H. Bechara, Vadim R. Viviani e Cassius V. Stevani, pode ser lido em: www.nature.com/articles/s41598-019-47753-w.

Descoberta na Amazônia enzima-chave para obtenção do etanol de segunda geração

11 de maio de 2018

José Tadeu Arantes | Agência FAPESP – A produção do etanol de segunda geração ou etanol celulósico, obtido a partir da palha e do bagaço da cana-de-açúcar, pode aumentar em até 50% a produção brasileira de álcool. Desnecessário enfatizar a importância econômica e ambiental dessa possibilidade, que transforma resíduo em recurso.

Proteína, codificada por gene encontrado em microrganismos do lago Poraquê, poderá potencializar a ação do coquetel enzimático necessário à sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar (imagem: Beta-Glucosidase Amazônica)


Para tanto, o país possui a melhor biomassa do planeta, a capacidade industrial instalada, a engenharia especializada e a levedura adequada. Só falta completar a composição do coquetel enzimático capaz de viabilizar o processo de sacarificação, por meio do qual os açúcares complexos (polissacarídeos) são despolimerizados e decompostos em açúcares simples. Compor uma plataforma microbiana industrial para a produção do conjunto de enzimas necessárias é o alvo de pesquisas avançadas na área.

Um importante resultado acaba de ser alcançado, com a descoberta, no lago Poraquê, na Amazônia, de microrganismos capazes de produzir uma enzima crítica para o êxito do empreendimento.
Isolada, caracterizada e produzida, a enzima mostrou-se compatível com duas fases essenciais da produção do etanol de segunda geração: a fermentação e a sacarificação. A realização simultânea dessas duas etapas oferece a perspectiva de uma grande redução de custos para a indústria sucroalcooleira, uma vez que as reações podem ocorrer em um único reator e há economia de reagentes.

O estudo mobilizou pesquisadores do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), da Petrobras, da Universidade de São Paulo (USP) e da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), e contou com apoio da FAPESP. Artigo assinado pela equipe de pesquisadores foi publicado na Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics.
“A sacarificação é a etapa mais cara do processo. De 30% a 50% do custo do etanol celulósico é despendido com as enzimas necessárias para transformar os açúcares complexos em açúcares simples. E, atualmente, a eficiência da conversão realizada por essas enzimas está entre 50% e 65%. Isso significa que de 50% a 35% do açúcar disponível na biomassa é ‘perdido’ durante a sacarificação. O grande propósito do nosso estudo foi encontrar biocatalisadores capazes de contribuir para o aumento da eficiência”, disse Mario Tyago Murakami do CNPEM, um dos coordenadores da pesquisa, à Agência FAPESP.

Segundo o pesquisador, no arsenal de enzimas necessárias, atuando de maneira sinérgica, as beta-glucosidases têm importância fundamental, porque respondem pela última fase da cascata de sacarificação da celulose.

“Sabemos que, à medida que aumenta o percentual do produto da sacarificação, a taxa do processo de sacarificação cai. Porque a presença do produto inibe a atuação das enzimas. Isso é uma espécie de regra geral. No caso específico, a glicose gerada restringe a atuação das beta-glucosidases. Esse gargalo tecnológico tem sido objeto de estudos exaustivos. Para aumentar a eficiência da sacarificação, é preciso que as beta-glucosidases sejam altamente tolerantes à presença da glicose”, disse Murakami.

Devido a especificidades genéticas, decorrentes de diferenças no processo evolutivo, enzimas homólogas podem apresentar variados graus de resistência à inibição pelo produto. E o alvo dos pesquisadores no estudo em pauta foi encontrar as beta-glucosidases mais adaptadas à biomassa existente no território brasileiro. Para isso, foram investigados os processos naturais que ocorrem em diferentes biomas do país, tanto na Floresta Amazônica como no Cerrado.
Flavio Henrique da Silva, da UFSCar, outro coordenador do estudo, foi o responsável por esse processo de bioprospecção. E o achado mais promissor ocorreu no lago Poraquê, na Amazônia, onde amostras da comunidade microbiana não cultivável local apresentaram genes codificadores de beta-glucosidases com o potencial industrial procurado.

“Em um habitat como o lago Poraquê os microrganismos adaptaram-se a uma alimentação muito rica em polissacarídeos, constituída por resíduos de madeira, folhas de plantas e etc. A enzima beta-glucosidase presente nesses microrganismos é distinta de enzimas homólogas resultantes de pressões evolutivas diferentes”, disse Murakami.

Sacarificação simultânea à fermentação

Em seus estudos enzimológicos, Silva verificou que a beta-glucosidase codificada pelos microrganismos do lago Poraquê apresentava eficiência catalítica para a sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar e tolerância expressiva à inibição pela glicose. O passo seguinte foi dado pela equipe de Murakami, especializada em biologia estrutural mecanística, que elucidou, em nível molecular e atômico, as bases do funcionamento dessa enzima.

“Foi um bom exemplo de trabalho em equipe, juntando grupos de prospecção, grupos de enzimologia, grupos de estudos mecanísticos, grupos de bioinformática e etc. Utilizamos equipamentos do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron e de outros laboratórios nacionais”, disse Murakami.

Em relação à estrutura molecular, o estudo oligomérico evidenciou uma proteína diferente das demais de sua categoria, com uma arquitetura quaternária única.

“Esse estudo corroborou pesquisas anteriores do grupo a respeito dos determinantes estruturais para a tolerância da enzima ao produto, validando nosso modelo mecanístico. Além disso, verificamos que essa beta-glucosidase atua em condições de temperatura e pH compatíveis com o processo de hidrólise”, disse Murakami.

Essa informação é muito relevante, porque indica que a enzima encontrada pode vir a compor um processo chamado de SSF: sacarificação simultânea à fermentação. Pelo fato de poder atuar em condições de temperatura compatíveis com o crescimento da levedura, essa beta-glucosidase propicia que a disponibilização do carboidrato resultante da sacarificação e sua fermentação pela levedura possam ocorrer ao mesmo tempo. Tal estratégia ajuda a mitigar o efeito de inibição pelo produto, porque, à medida que o açúcar é produzido, ele também vai sendo consumido pela levedura, o que alivia a enzima da inibição por uma quantidade excessiva de glicose.

O passo seguinte é fazer estudos de combinação dessa enzima com os coquetéis enzimáticos fúngicos já existentes, visando o ganho de eficiência no aumento da sacarificação.

“Uma vez extraído o gene de interesse, a partir de bibliotecas gênicas de microrganismos não cultiváveis e de possíveis modificações racionais baseadas no conhecimento da estrutura para aumento de termoestabilidade, ele é transferido para outros hospedeiros por meio de técnicas de biologia molecular.

O hospedeiro em questão é o trichoderma, um fungo filamentoso que já possui um arsenal de enzimas ativas sobre carboidratos. Com a adição da beta-glucosidase amazônica, ele terá seu potencial aumentado. Trata-se de potencializar uma plataforma microbiana industrial já existente”, disse Murakami. O objetivo da equipe é patentear o fungo engenheirado com a enzima.