Glóbulos vermelhos

Ativos naturais

Glóbulos vermelhos do sangue são fonte de proteínas e lipídeos para a produção de pequenas cápsulas e candidatos a medicamentos 

DINORAH ERENO | ED. 232 | JUNHO 2015

Pesquisadores de Brasília encontraram no sangue matéria-prima para encapsular moléculas com uso potencial contra cânceres, fungos e bactérias em futuras aplicações terapêuticas. Das hemácias, eles obtiveram fosfolipídeos, uma espécie de gordura empregada na fabricação de lipossomos – nanoestrutura semelhante a pequenas cápsulas esféricas, utilizada para transportar fármacos e cosméticos para regiões específicas do corpo. Ainda a partir das hemácias, mais especificamente da proteína hemoglobina encontrada nos glóbulos vermelhos, também conhecidos como eritrócitos, eles extraíram peptídeos (fragmentos de proteína) com atividades farmacológicas. “Proteínas como a hemoglobina possuem inúmeros peptídeos internos à sua estrutura que podem apresentar bioatividade distinta daquela da proteína original”, explica Luciano Paulino da Silva, coordenador do grupo de Nanobiotecnologia da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. “Desde a década de 1980 existem relatos na literatura científica de que fragmentos de proteínas contêm atividades biológicas”, relata. “Mas, pelas pesquisas que fizemos, esses fragmentos ainda não haviam sido aplicados na forma de nanossistemas como constituintes de lipossomos.”

A pesquisa, conduzida em parceria com a Embrapa e a Universidade de Brasília (UnB), resultou em um depósito de patente tanto pela obtenção dos peptídeos como pela estratégia utilizada para a produção de lipossomos. “Extraímos os fosfolipídeos das membranas das hemácias e formulamos os lipossomos a partir do próprio componente da célula”, relata Luciano. “A obtenção de lipossomos de hemácias realmente é uma inovação porque os similares comerciais disponíveis no mercado são preparados a partir de fosfolipídeos sintéticos ou naturais a partir de gemas de ovos e de outras fontes”, diz Eneida de Paula, professora do Departamento de Bioquímica, do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

Os estudos que resultaram nesse trabalho foram conduzidos pela bióloga Cínthia Caetano Bonatto durante a sua dissertação de mestrado na UnB, orientada por Luciano. O pesquisador lidera um grupo na Embrapa que estuda alternativas para resíduos agropecuários que são, em geral, descartados. No caso, foi utilizado sangue bovino e de camundongo. De um boi de tamanho médio abatido, por exemplo, pode-se obter até 20 litros de sangue. “Os lipossomos que formulamos têm potencial de uso para diversos tipos de fármacos”, diz Cínthia, que continua a se dedicar ao tema no doutorado, em que também utiliza plantas. Algumas de suas possíveis aplicações são em quimioterapias, para reduzir os efeitos adversos do tratamento. Ou ainda como bioativos na indústria química e farmacêutica tanto animal como humana, para possíveis tratamentos de doenças.
Outros compontentes do sangue, como peptídeos, também são estudados pelo pesquisador. “A hemoglobina apresenta similaridade celular entre diferentes organismos, o que abre um leque de possibilidades para uso da tecnologia”, relata Luciano. Como a hemoglobina é uma proteína com quase 600 aminoácidos, para extrair apenas os peptídeos de interesse para a pesquisa – entre 5 e 20 – foi preciso colocá-la em meio aquoso com uma enzima específica para essa finalidade, processo chamado de hidrólise enzimática. Os peptídeos extraídos foram colocados dentro de lipossomos, que tem potencial de levar o fármaco para a célula do organismo que necessita de tratamento. A avaliação dos efeitos antitumorais dos peptídeos foi feita a partir da hemoglobina hidrolisada de camundongo in vitro, em um modelo para estudo de câncer de mama. Os testes foram conduzidos em laboratório pela bióloga Graziella Anselmo Joanitti, professora da UnB, que trabalha com aplicação de nanotecnologia na biomedicina na área de câncer, e por Cínthia, com células isoladas de câncer de mama de camundongos. “Inicialmente, fizemos testes com peptídeos administrados na forma livre e observamos um efeito sutil na redução da viabilidade das células tumorais”, relata Graziella. Em seguida, foram testados componentes peptídicos da hemoglobina na forma nanoestruturada. “Quando encapsulados em lipossomos, o efeito antitumoral in vitro foi bem mais expressivo.”

Câncer e agricultura

Na primeira etapa da pesquisa, o conjunto de todos os peptídeos obtidos passou por testes. Na próxima fase, os pesquisadores farão a identificação das moléculas com papel mais preponderante na redução de células tumorais in vitro e irão investigar os mecanismos de ação envolvidos. Graziella ressalta que os lipossomos constituídos pelos próprios componentes das hemácias, quando utilizados para transporte de bioativos, possivelmente não são reconhecidos como invasores pelo organismo.

A expectativa dos pesquisadores brasilienses é futuramente utilizar essa estratégia para tratamento de câncer em humanos, mas para isso toda uma sequência de testes pré-clínicos e clínicos precisa ser seguida. Por enquanto, eles estão na fase de estabelecimento de colaborações com outros grupos de pesquisa da Embrapa para procurar novos fármacos destinados ao tratamento de doenças causadas por microrganismos como bactérias patogênicas e também por parasitas que provocam grandes prejuízos à agropecuária nacional, como berne – uma larva da mosca Dermatobia hominis –, infestação por carrapato e pela mosca-dos-chifres.

Cientistas exploram microbiota de formigas em busca de novos fármacos

11/07/2014

Por Karina Toledo
Agência FAPESP – Como os moradores de grandes cidades bem sabem, ambientes com grande aglomeração de indivíduos são favoráveis à disseminação de patógenos e, portanto, requerem cuidados para evitar doenças.

Se nós humanos podemos contar com vacinas, remédios e desinfetantes para nos proteger, os insetos sociais – como abelhas, formigas e cupins – também desenvolveram ao longo de milhares de anos de evolução suas próprias “armas químicas”, que agora começam a ser exploradas pela ciência.

Projeto reúne pesquisadores da USP e de Harvard e foi aprovado na primeira chamada conjunta lançada pela FAPESP e pelo NIH (foto: Michael Poulsen/capa: Eduardo Afonso da Silva Jr.) 

“Uma das estratégias usadas por insetos que vivem em colônias é a associação com microrganismos simbiontes – na maioria das vezes bactérias – capazes de produzir compostos químicos com ação antibiótica e antifúngica”, contou Monica Tallarico Pupo, professora da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) da Universidade de São Paulo (USP).

Em um projeto recentemente aprovado na primeira chamada de propostas conjunta lançada pela FAPESP e pelo National Institutes of Health (NIH), dos Estados Unidos, a equipe de Pupo vai se unir ao grupo de Jon Clardy, da Harvard University, para explorar a microbiota existente nos corpos de formigas brasileiras em busca de moléculas naturais que possam dar origem a novos fármacos.

“Vamos nos concentrar inicialmente nas espécies de formigas cortadeiras, como a saúva, pois são as que têm essa relação de simbiose mais bem descrita na literatura científica”, disse Pupo.
De acordo com a pesquisadora, as formigas cortadeiras se comportam como verdadeiras agricultoras, carregando pedaços de planta para o interior do ninho com o intuito de nutrir as culturas de fungos das quais se alimentam. “Isso cria um ambiente rico em nutrientes e suscetível ao ataque de microrganismos oportunistas. Para manter a saúde do formigueiro, é importante que tenham os simbiontes associados”, explicou Pupo.

Os pesquisadores sairão à caça de formigas em parques nacionais localizados em diferentes biomas brasileiros, como Cerrado, Mata Atlântica, Amazônia e Caatinga. Também fará parte da área de coleta o Parque Estadual Vassununga, no município de Santa Rita do Passa Quatro (SP).
A meta do grupo é isolar cerca de 500 linhagens de bactérias por ano o que, estima-se, dê origem a cerca de 1.500 diferentes extratos. “O primeiro passo será coletar os insetos e fragmentos do ninho para análise em laboratório. Em seguida, vamos isolar as linhagens de bactérias existentes e usar métodos de morfologia e de sequenciamento de DNA para caracterizar os microrganismos”, contou Pupo.
Depois que as bactérias estiverem bem preservadas e catalogadas, acrescentou a pesquisadora, será possível cultivar as linhagens para, então, extrair o caldo de cultivo. “Nossa estimativa é que cada linhagem dê origem a três diferentes extratos, de acordo com o nutriente usado no cultivo e a técnica de extração escolhida”, disse.
Esses extratos serão testados in vitro para avaliar se são capazes de inibir o crescimento de fungos, células cancerígenas e de parasitas causadores de leishmanioses e doença de Chagas. Os mais promissores terão os princípios ativos isolados e estudados mais profundamente.
“Nesse tipo de pesquisa é comum ter redundância, ou seja, isolar compostos já conhecidos na literatura. Para agilizar a descoberta de novas substâncias ativas vamos usar ferramentas de desreplicação e de sequenciamento genômico”, disse Pupo.

Também farão parte da equipe o bacteriologista Cameron Currie (University of Wisconsin-Madison), Fabio Santos do Nascimento (Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP), André Rodrigues (Universidade Estadual Paulista em Rio Claro), Adriano Defini Andricopulo (Instituto de Física de São Carlos, da USP), James E. Bradner (Harvard Medical School), Dana-Farber (Cancer Institute), Timothy Bugni (University of Wisconsin – Madison) e David Andes (University of Wisconsin – Madison).
A chamada Fapesp/NIH está vinculada ao programa International Biodiversity Cooperative Groups (ICBG), do qual o Brasil participa pela primeira vez.

Início

Segundo Pupo, o projeto colaborativo é uma ampliação do trabalho que vem sendo realizado no âmbito de um Auxílio Regular aprovado em meados de 2013, que também conta com a colaboração de Clardy e de Currie.

“Estamos estudando uma espécie de abelha [ Scaptotrigona depilis] e uma espécie de formiga [Atta sexdens] encontradas no campus da USP em Ribeirão Preto. Nesse caso, exploramos toda a microbiota dos insetos, tanto bactérias quanto fungos, e alguns compostos isolados estão apresentando potencial antibacteriano e antifúngico bastante acentuado”, contou.

O trabalho está sendo desenvolvido durante o doutorado de Eduardo Afonso da Silva Júnior e Camila Raquel Paludo – ambos com Bolsa da FAPESP. Também tem a participação da bolsista de Iniciação Científica Taise Tomie Hebihara Fukuda.

Grupo desenvolve métodos para detectar resíduos de fármacos veterinários em peixes

04/11/2013

Por Karina Toledo
Agência FAPESP – Desenvolver métodos para detectar resíduos de fármacos veterinários em peixes que possam ser úteis para programas de vigilância sanitária é o objetivo de um grupo de pesquisadores coordenado por Felix Guillermo Reyes Reyes, professor da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (FEA/Unicamp).

Projeto coordenado pelo pesquisador Felix Guillermo Reyes Reyes, da Unicamp, é realizado no âmbito de um acordo entre a FAPESP e a Agilent Technologies (foto: Neuza Campelo/Embrapa Amazônia Ocidental)

O projeto, que também envolve pesquisadores do Instituto de Química da Unicamp, da Universidade Estadual Paulista (Unesp) e da Embrapa, foi um dos aprovados na chamada de propostas lançada em abril de 2013 pela FAPESP e pela Agilent Technologies.

“Vamos estudar como os fármacos veterinários são absorvidos e metabolizados pelas três espécies de peixes de maior valor comercial no Brasil: tilápia, tambaqui e pacu. Realizaremos estudos de depleção de resíduos, particularmente em filé de peixes, que é a parte consumida, a fim de saber quanto tempo leva para que a substância administrada esteja abaixo do limite máximo permitido e não ofereça risco à saúde humana. Assim, poderemos estabelecer o período de carência entre a última aplicação do medicamento e o momento em que o peixe é abatido para consumo”, explicou Reyes.

Serão desenvolvidos métodos analíticos tanto para a determinação de moléculas específicas como métodos multirresíduos. Do ponto de vista da vigilância sanitária, um dos objetivos é avaliar o uso de substâncias não aprovadas para a piscicultura.

“Há atualmente apenas dois antimicrobianos registrados no país para uso na piscicultura – provavelmente por falta de interesse das empresas de medicamentos veterinários em licenciar seus produtos para uso no setor. Existe, por outro lado, uma forte suspeita de que os criadores estejam utilizando produtos registrados para outras espécies animais, pois os peixes criados nessas condições estão sob forte estresse e, portanto, muito suscetíveis a infecções. Mas esse uso ilegal é feito sem qualquer estudo para verificar a dose adequada e sem avaliação de risco”, disse Reyes.

Além da ameaça à saúde dos consumidores, alertou Reyes, o uso não controlado de fármacos veterinários na piscicultura pode trazer prejuízos ambientais e contribuir para o desenvolvimento de resistência bacteriana aos antimicrobianos hoje existentes.
“Algumas dessas substâncias foram estudadas em outros países para uso na piscicultura, mas os resultados não são necessariamente válidos para o Brasil, pois as condições ambientais são diferentes e as espécies estudadas também. Tudo isso influencia a forma como o fármaco é metabolizada e, consequentemente, o período de carência”, disse Reyes.
O professor da Unicamp apresentou detalhes do projeto em um simpósio organizado pela FAPESP e pela Agilent no dia 30 de outubro. Na ocasião, Reyes afirmou que o Brasil, com 12% da água doce disponível do planeta, reúne condições para se tornar o maior exportador de peixes e derivados do mundo.
“Para o governo federal, a aquicultura é uma atividade importante do agronegócio. A FAO [Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura] considera o Brasil como o principal país para produzir peixes que ajudarão a alimentar a população mundial nos próximos 20 anos. Mas precisamos tomar cuidado para não poluirmos o ambiente nessa empreitada. A pesquisa científica é fundamental para garantir a qualidade da produção e a integridade do meio ambiente”, disse.

Doença de Gaucher

Outro projeto aprovado na chamada de propostas FAPESP-Agilent foi apresentado pela professora Aparecida Maria Fontes, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP). O objetivo é desenvolver um novo medicamento para o tratamento da doença de Gaucher.

Classificada como um erro inato do metabolismo, essa doença genética se caracteriza pela deficiência na produção da enzima beta-glicosidase, também conhecida como glicocerebrosidase. Essa enzima está envolvida no metabolismo de lipídios no interior das células, mais especificamente do glicocerebrosídeo.
Nos portadores da doença de Gaucher, a quantidade da enzima é insuficiente para decompor o glicocerebrosídeo na velocidade ideal e esse lipídio acaba se acumulando nos lisossomos das células, afetando principalmente o fígado, o baço e a medula óssea, mas podendo também acometer outros órgãos, como o sistema nervoso central (no caso dos subtipos II e III da doença). 

Além de aumento no volume abdominal resultante do inchaço do baço e do fígado, os sintomas incluem anemia, trombocitopenia (redução do número de plaquetas no sangue) e dor nos ossos.

“Existem, atualmente, quatro proteínas comerciais para fazer a terapia de reposição enzimática para os portadores da doença de Gaucher. Nosso objetivo é, por meio de ferramentas da biologia sintética, desenvolver uma plataforma otimizada para produzir a enzima beta-glicosidase. O projeto conta com algumas inovações que vão aumentar a produtividade e tornar o produto mais barato”, contou Fontes.
Os biofármacos usados na terapia de reposição enzimática para doenças de disfunção lisossomal, explicou a pesquisadora, são produzidas em diferentes tipos de linhagens celulares e requerem diversas modificações para a entrega nos tecidos alvos acometidos pela doença.
O grupo coordenado por Fontes – que inclui pesquisadores da Genética Médica do Departamento de Genética e do Departamento de Cirurgia e Anatomia da FMRP/USP e também do Departamento de Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP – pretende desenvolver, com ajuda de vetores virais, uma linhagem de células humanas capazes de produzir níveis muito mais altos da enzima.

“Vamos usar um vírus incapaz de se replicar no meio celular, mas que contém elementos que vão se recombinar e se integrar ao genoma da célula hospedeira. Como consequência, a célula passa a ter expressão permanente do gene de interesse. Mas, em vez de utilizar a tecnologia do DNA recombinante, vamos usar técnicas da biologia sintética para desenvolver o genoma do nosso veículo de expressão, que é o vírus”, disse Fontes.
Segundo a pesquisadora, a plataforma desenvolvida para a produção da enzima poderá depois ser adaptada para obter biofármacos úteis no tratamento de outras doenças genéticas que afetam o metabolismo – algumas atualmente sem opções terapêuticas, como a doença de Nieman-Pick, a mucopolissacaridose tipo IVA, α-manosidose, entre outras.

Mapa metabólico

O seminário promovido pela FAPESP e pela Agilent contou ainda com a participação do pesquisador Paulo Mazzafera, do Instituto de Biologia da Unicamp, que coordena um projeto aprovado na primeira chamada de propostas, lançada em 2011.
O objetivo de Mazzafera e de seus colaboradores no projeto é descobrir como a variação de temperatura e da concentração de dióxido de carbono (CO2) na atmosfera influenciam a síntese de lignina (substância estratural da planta) em duas espécies de eucalipto: a Eucalyptus globulus, que é nativa de regiões frias e oferece um maior rendimento na produção de celulose, e a Eucalyptus grandis, espécie comum no Brasil, que possui um tipo de lignina mais difícil de ser removida para a obtenção da celulose.

“A ideia é entender como funciona o metabolismo dessas espécies e, com base nessas informações, pensar em trabalhar com determinados genes para alterar a via de lignina na planta”, disse Mazzafera.
No primeiro ano do projeto, os pesquisadores mediram diversos parâmetros fisiológicos das duas espécies – como crescimento, fotossíntese e produção de açúcares – em faixas variando de 5ºC a 35ºC.
Foram então definidas três faixas de temperatura para o experimento principal: 10ºC, 25ºC e 35ºC. Para cada faixa de temperatura, foram simuladas duas concentrações de CO2: 380 partícula por milhão (ppm), que é a concentração média da atmosfera terrestre, e 700 ppm (prevista pelo Painel Intergovernamental sobre Mudanças Climáticas – IPCC – para os próximos anos).

“As plantas foram crescidas por aproximadamente 30 dias nessas condições. Coletamos material e agora vamos começar a análise metabolômica, ou seja, avaliar os vários metabólitos que a planta produz. Vamos também fazer a análise transcriptômica, que consiste em um banco de RNAs mensageiros que permite ver o que está mais ou menos expresso em cada situação. No nosso caso, o foco é a síntese de lignina, mas certamente o banco será suficientemente rico para se estudar outras várias respostas metabólicas às condições em que as plantas cresceram”, contou.
Para fazer as análises, contou Mazzafera, a Agilent disponibilizou um software conhecido como GeneSpring, capaz de integrar os dados de metabolômica e de transcriptômica e gerar um mapa metabólico da planta.

Parceria em pesquisa

Na abertura do simpósio, o diretor-presidente do Conselho Técnico-Administrativo da FAPESP, José Arana Varela, destacou a importância de reunir pesquisadores que tiveram projetos aprovados nas duas chamadas de propostas para promover a troca de experiências.
“Este programa começou em 2011 e tem sido muito bem-sucedido. Esta é uma oportunidade de fazer uma avaliação e ver se há pontos a serem melhorados”, disse Varela.
Jack Wonstrand, diretor de relações com universidades da Agilent, ressaltou que a empresa tem um forte compromisso acadêmico no Brasil. “Nenhum lugar no país é mais importante para nós que o Estado de São Paulo. Estamos concentrados em construir nossas relações acadêmicas aqui e a experiência de trabalhar com a FAPESP tem sido excelente. Nada acontece sem uma administração eficiente. Queremos que os pesquisadores participantes realmente façam progressos diligentes e tenham um entendimento claro do que queremos alcançar. Para isso, essas reuniões são fundamentais”, afirmou.
O total de recursos disponível para atender as propostas selecionadas na segunda chamada de propostas é equivalente a US$ 800 mil, igualmente compartilhados entre FAPESP e Agilent. As propostas foram apresentadas de acordo com as normas do Programa Pesquisa em Parceria para Inovação Tecnológica (PITE) da FAPESP.