Descoberta nova família de toxinas usada em guerras bacterianas

14 de setembro de 2020

André Julião | Agência FAPESP – Pesquisadores da Universidade de São Paulo (USP) apoiados pela FAPESP caracterizaram uma nova família de toxinas antibacterianas presente em bactérias, entre elas a Salmonella enterica. Nessa espécie, a proteína tóxica é usada para matar outras bactérias da microbiota intestinal e facilitar a colonização do intestino de hospedeiros infectados.

O estudo, publicado na Cell Reports, foi destaque na capa da revista.

O membro fundador da nova família é a proteína Tlde1 (sigla para type VI L,D-transpeptidase effector 1), que ataca precursores da parede celular bacteriana. A molécula é secretada por um sistema denominado T6SS (type VI secretion system). Quando a bactéria-alvo é intoxicada, continua crescendo. Mas como sua parede celular está enfraquecida, acaba morrendo devido a um fenômeno chamado pressão osmótica, que faz com que seu conteúdo extravase.

“Essa família de toxinas possui um mecanismo nunca antes descrito. Enquanto outras toxinas antibacterianas secretadas pelo mesmo sistema destroem a parede celular das bactérias-alvo quando ela já está formada, esta atua nos precursores dessa estrutura, prejudicando a sua formação”, explica Ethel Bayer Santos, pesquisadora do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB-USP) e coordenadora do projeto apoiado pela FAPESP.

Em um trabalho anterior, a pesquisadora fez parte de uma equipe que descreveu a existência de outro sistema de secreção (T4SS), desta vez em bactérias oportunistas da espécie Stenotrophomonas maltophilia. O artigo também descreveu uma toxina que inibe o crescimento bacteriano, deixando as células-alvo em estado de dormência. O mecanismo de ação da proteína, porém, ainda não foi desvendado (leia mais em: agencia.fapesp.br/32161).

“As bactérias selecionaram essas toxinas durante a evolução e fazem uso delas há milhares de anos, o que as torna potenciais alvos terapêuticos. Podem, futuramente, dar origem a um composto antibacteriano”, diz a pesquisadora.

Mapeamento do genoma

Para encontrar a proteína Tlde1, os pesquisadores analisaram o genoma da Salmonella com foco na região próxima aos genes que codificam as proteínas estruturais do sistema de secreção (T6SS). Encontraram um par de genes com características que indicavam serem codificadores de proteínas com ação antagônica: uma tóxica e outra capaz de neutralizar a toxicidade. No genoma das bactérias, as toxinas antibacterianas geralmente estão localizadas próximas a proteínas que conferem imunidade, para evitar que ocorra autointoxicação.

Para testar a função desse par de genes, os pesquisadores, inicialmente, expressaram aquele que suspeitavam ser responsável pela proteína tóxica em uma bactéria suscetível, a Escherichia coli. A bactéria sobreviveu quando o suposto gene tóxico foi expresso no citoplasma, mas morreu quando a expressão ocorreu no periplasma (estrutura entre o citoplasma e a parede celular), indicando que a toxina tinha como alvo alguma estrutura nesse compartimento da célula bacteriana.

Em seguida, foram expressos no periplasma da E. coli não só a proteína tóxica, mas também a provável proteína de imunidade. A coexpressão neutralizou o efeito tóxico e fez a bactéria sobreviver, confirmando que as duas moléculas são, respectivamente, uma toxina e uma proteína de imunidade.

O sistema de secreção de proteínas T6SS é evolutivamente relacionado ao aparato de bacteriófagos (vírus que infectam bactérias). Ele é composto por 13 proteínas estruturais que se organizam em formato de lança, com uma ponta perfurante envolta por uma bainha contrátil. A célula atacante ejeta a lança cheia de proteínas tóxicas por meio dessa bainha em direção à célula-alvo.

Análises de bioinformática revelaram que membros da família Tlde1 existem em diversas espécies bacterianas, e que essa família provavelmente evoluiu de enzimas bacterianas que participam da síntese da parede celular. O próximo passo da pesquisa é tentar entender, com técnicas de biologia estrutural, como uma enzima que tinha essa função passou a fazer o oposto.

A pesquisa teve como primeiras autoras Stephanie Sibinelli-Sousa e Julia Takuno Hespanhol. Sibinelli-Sousa atualmente realiza mestrado no ICB-USP com bolsa da FAPESP.

Os outros coautores foram Gianlucca Gonçalves Nicastro, Robson Francisco de Souza e Cristiane Rodrigues Guzzo Carvalho, do ICB-USP, e Bruno Yasui Matsuyama, do Instituto de Química (IQ) da USP, além de Stephane Mesnage e Ankur Patel, da Universidade de Sheffield, no Reino Unido.

O artigo A Family of T6SS Antibacterial Effectors Related to l,d-Transpeptidases Targets the Peptidoglycan pode ser lido em: www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(20)30794-4.

Cientistas exploram microbiota de formigas em busca de novos fármacos

11/07/2014

Por Karina Toledo
Agência FAPESP – Como os moradores de grandes cidades bem sabem, ambientes com grande aglomeração de indivíduos são favoráveis à disseminação de patógenos e, portanto, requerem cuidados para evitar doenças.

Se nós humanos podemos contar com vacinas, remédios e desinfetantes para nos proteger, os insetos sociais – como abelhas, formigas e cupins – também desenvolveram ao longo de milhares de anos de evolução suas próprias “armas químicas”, que agora começam a ser exploradas pela ciência.

Projeto reúne pesquisadores da USP e de Harvard e foi aprovado na primeira chamada conjunta lançada pela FAPESP e pelo NIH (foto: Michael Poulsen/capa: Eduardo Afonso da Silva Jr.) 

“Uma das estratégias usadas por insetos que vivem em colônias é a associação com microrganismos simbiontes – na maioria das vezes bactérias – capazes de produzir compostos químicos com ação antibiótica e antifúngica”, contou Monica Tallarico Pupo, professora da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) da Universidade de São Paulo (USP).

Em um projeto recentemente aprovado na primeira chamada de propostas conjunta lançada pela FAPESP e pelo National Institutes of Health (NIH), dos Estados Unidos, a equipe de Pupo vai se unir ao grupo de Jon Clardy, da Harvard University, para explorar a microbiota existente nos corpos de formigas brasileiras em busca de moléculas naturais que possam dar origem a novos fármacos.

“Vamos nos concentrar inicialmente nas espécies de formigas cortadeiras, como a saúva, pois são as que têm essa relação de simbiose mais bem descrita na literatura científica”, disse Pupo.
De acordo com a pesquisadora, as formigas cortadeiras se comportam como verdadeiras agricultoras, carregando pedaços de planta para o interior do ninho com o intuito de nutrir as culturas de fungos das quais se alimentam. “Isso cria um ambiente rico em nutrientes e suscetível ao ataque de microrganismos oportunistas. Para manter a saúde do formigueiro, é importante que tenham os simbiontes associados”, explicou Pupo.

Os pesquisadores sairão à caça de formigas em parques nacionais localizados em diferentes biomas brasileiros, como Cerrado, Mata Atlântica, Amazônia e Caatinga. Também fará parte da área de coleta o Parque Estadual Vassununga, no município de Santa Rita do Passa Quatro (SP).
A meta do grupo é isolar cerca de 500 linhagens de bactérias por ano o que, estima-se, dê origem a cerca de 1.500 diferentes extratos. “O primeiro passo será coletar os insetos e fragmentos do ninho para análise em laboratório. Em seguida, vamos isolar as linhagens de bactérias existentes e usar métodos de morfologia e de sequenciamento de DNA para caracterizar os microrganismos”, contou Pupo.
Depois que as bactérias estiverem bem preservadas e catalogadas, acrescentou a pesquisadora, será possível cultivar as linhagens para, então, extrair o caldo de cultivo. “Nossa estimativa é que cada linhagem dê origem a três diferentes extratos, de acordo com o nutriente usado no cultivo e a técnica de extração escolhida”, disse.
Esses extratos serão testados in vitro para avaliar se são capazes de inibir o crescimento de fungos, células cancerígenas e de parasitas causadores de leishmanioses e doença de Chagas. Os mais promissores terão os princípios ativos isolados e estudados mais profundamente.
“Nesse tipo de pesquisa é comum ter redundância, ou seja, isolar compostos já conhecidos na literatura. Para agilizar a descoberta de novas substâncias ativas vamos usar ferramentas de desreplicação e de sequenciamento genômico”, disse Pupo.

Também farão parte da equipe o bacteriologista Cameron Currie (University of Wisconsin-Madison), Fabio Santos do Nascimento (Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP), André Rodrigues (Universidade Estadual Paulista em Rio Claro), Adriano Defini Andricopulo (Instituto de Física de São Carlos, da USP), James E. Bradner (Harvard Medical School), Dana-Farber (Cancer Institute), Timothy Bugni (University of Wisconsin – Madison) e David Andes (University of Wisconsin – Madison).
A chamada Fapesp/NIH está vinculada ao programa International Biodiversity Cooperative Groups (ICBG), do qual o Brasil participa pela primeira vez.

Início

Segundo Pupo, o projeto colaborativo é uma ampliação do trabalho que vem sendo realizado no âmbito de um Auxílio Regular aprovado em meados de 2013, que também conta com a colaboração de Clardy e de Currie.

“Estamos estudando uma espécie de abelha [ Scaptotrigona depilis] e uma espécie de formiga [Atta sexdens] encontradas no campus da USP em Ribeirão Preto. Nesse caso, exploramos toda a microbiota dos insetos, tanto bactérias quanto fungos, e alguns compostos isolados estão apresentando potencial antibacteriano e antifúngico bastante acentuado”, contou.

O trabalho está sendo desenvolvido durante o doutorado de Eduardo Afonso da Silva Júnior e Camila Raquel Paludo – ambos com Bolsa da FAPESP. Também tem a participação da bolsista de Iniciação Científica Taise Tomie Hebihara Fukuda.

Estudo com formigas avalia recuperação da Mata Atlântica

14/03/2014

Por Ivonete Lucirio
Agência FAPESP – Uma forma de verificar a saúde de um ecossistema é avaliar a variedade de espécies que nele vivem. Pesquisadores da Universidade de Mogi das Cruzes (UMC) valeram-se dessa premissa ao quantificar espécies de formigas de serapilheira em uma região entre as Bacias Hidrográficas do Alto Tietê e do Rio Itatinga, na cidade de Mogi das Cruzes, na divisa com Bertioga (SP).

Serapilheira é uma camada que mistura fragmentos de folhas, galhos e outros materiais orgânicos em decomposição, que fica sobre o solo das matas, formando húmus. O material abriga um rico ecossistema, composto por uma grande variedade de artrópodes, fungos e bactérias. Muitas espécies de formigas que constroem ninhos no solo visitam a região da serapilheira para coletar alimentos.
Ao contrário de formigas generalistas – como é o caso da maioria encontrada em ambientes urbanos –, as que vivem na serapilheira são em geral mais especialistas. Na serapilheira de florestas sem a interferência do homem, ocorrem diversas interações ecológicas que possibilitam a existência de outros pequenos animais que servem de alimento para as formigas.


 

Insetos são considerados biomarcadores da saúde de um ecossistema; análise em áreas anteriormente ocupadas por eucaliptos foi realizada por pesquisadores da UMC (foto: Silvia Sayuri Suguituru)

No caso do estudo “Estrutura das comunidades de formigas de serapilheira em cultivo extensivo da Eucalyptus grandis dunnil Maiden, em áreas de Mata Atlântica”, coordenado por Maria Santina de Castro Morini, da UMC, as formigas de serapilheira foram usadas como um marcador biológico para verificar a capacidade de recuperação de áreas uma vez cobertas por Mata Atlântica nativa.
Na região escolhida para a análise foram pesquisados três tipos de ambientes: áreas em que a Mata Atlântica foi retirada para a plantação de eucaliptos, ainda em atividade; áreas em que o plantio foi desativado entre 28 e 30 anos atrás por pressões conservacionistas ou dificuldade de manejo; e unidades de conservação (UC) com mata nativa.
Nas áreas nunca desmatadas, foi possível encontrar, por metro quadrado, cerca de 25 espécies de formigas de serapilheira – do total de mais de 200 existentes. Nas florestas de eucaliptos, por outro lado, o número não passou de cinco por metro quadrado. “Essa diferença se dá por vários fatores, mas principalmente porque as folhas de eucalipto se decompõem mais lentamente e têm altos teores de tanino, que é tóxico para muitos organismos que servem de alimento para as formigas”, disse Morini, professora do curso de Ciências Biológicas da UMC.
Já em regiões onde a plantação foi desativada há cerca de 30 anos e a Mata Atlântica voltou a ocupar espaço, a média encontrada foi de 18 espécies por metro quadrado – sinal de que a mata foi capaz de se recuperar, assim como a fauna da região. A pesquisadora escolheu estudar regiões em que a plantação estava desativada havia cerca de 30 anos - ehavia várias delas -, permitindo a obtenção de dados mais seguros (por serem coletados em mais de uma área).
Para fazer a contagem, Morini trabalhou de julho de 2010 a julho de 2013 especialmente na região da Bacia Hidrográfica do Alto Tietê. Seu grupo de pesquisadores demarcava áreas de um metro quadrado de serapilheira – fosse em área de plantação de eucalipto, mata nativa ou plantação abandonada – e levava o material para o laboratório, onde as formigas eram contadas. Para cada área estudada foram retiradas seis amostras, totalizando 120 amostras de serapilheira.

Morini trabalhou em sintonia com um grupo de pesquisadores do Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo (USP) durante a realização dos projetos “Riqueza e diversidade de Hymenoptera e Isoptera ao longo de um gradiente latitudinal de Mata Atlântica – a floresta pluvial do leste do Brasil” e “Biodiversity of Isoptera and Hymenoptera”, sob a coordenação dos professores Carlos Roberto Ferreira Brandão e Eliana Cancello. “Toda a metodologia que usei foi discutida para que os resultados pudessem ser comparados. Eu participava das reuniões para aprender o desenho amostral e as técnicas de coleta que seriam usadas no projeto deles e assim fazer no meu”, contou Morini.

Estudo sobre a microbiota

Em outro trabalho, intitulado “Diversidade de bactérias e de invertebrados e sua influência sobre a estrutura das comunidades de formigas de serapilheira em áreas de Mata Atlântica”, realizado também entre 2010 e 2013, a pesquisadora avaliou a diversidade de bactérias e de invertebrados e sua influência sobre a estrutura das comunidades de formigas.
A Mata Atlântica na região do Alto Tietê é protegida em áreas de barragens, unidades de conservação (UCs) e propriedades particulares. A pesquisa foi feita em fragmentos dessas áreas buscando avaliar o número de fungos e bactérias das amostras.
As áreas de floresta protegidas pelos órgãos públicos responsáveis pelas barragens e em propriedades particulares que valorizam o conservacionismo têm diversidade similar às UCs – indicando, segundo a pesquisadora, a importância dos fragmentos das barragens e das propriedades particulares para a proteção da biodiversidade da Mata Atlântica. “Minha pesquisa mostra que não apenas as UCs são importantes para o Alto Tietê, mas também as demais áreas; é preciso criar incentivos para que elas não sejam desflorestadas”, diz Morini.

A microbiota, por meio da decomposição do material orgânico, possibilita a existência de outros invertebrados (acarinas e colêmbolos, por exemplo) que servem de alimento para as formigas. É de se esperar que onde há mais microrganismos também existam mais espécies de formigas. A comprovação da hipótese, no entanto, ainda precisa ser feita.

“Ainda não podemos afirmar nada sobre a associação da microbiota e a riqueza de formigas. Esperamos fechar em breve o modelo que foi proposto no projeto”, disse Morini à Agência FAPESP.
Os resultados das duas pesquisas coordenadas por Morini devem ser publicados até o fim deste ano. “Por enquanto, estamos preparando um manuscrito para a Biological Conservation”, disse Morini.
Resultados parciais já renderam publicações como: Undecomposed twigs in the leaf litter as nest-building resources for ants (Hymenoptera: Formicidae) in areas of the Atlantic Forest in the southeastern region of Brazil, de Morini e outros, que pode ser lido na Psyche; Characterization of ant communities (Hymenoptera: Formicidae) in twigs in the leaf litter of the Atlantic Rainforest and eucalyptus trees in the southeast region of Brazil, de Morini e outros, que também está disponível na Psyche; e Occurrence and natural history of Myrmelachista Roger (Formicidae: Formicinae) in the Atlantic Forest of southeastern Brazil, de Morini e outros, publicado na Revista Chilena de Historia Natural. 

Imagens

Durante suas pesquisas, Morini fotografou em laboratório e catalogou 235 espécies de formigas que vivem no Alto Tietê, no âmbito do projeto “Coleção biológica da fauna de formigas do Alto Tietê: organização de um acervo fotográfico”.

O resultado poderá ser visto em um catálogo com previsão de publicação para abril de 2014. Além das fotos, haverá textos contextualizando o ambiente em que essas formigas vivem, escritos por vários colaboradores, como Ramon Luciano de Melo, da Universidade Federal do Mato Grosso (UFMT), e Jacques Delabie, da Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (Ceplac).

A publicação abordará as coleções biológicas e a conservação da biodiversidade. O catálogo está sendo organizado por Morini; Silvia Sayuri Suguituru, também da UMC; Rodrigo Feitosa, da Universidade Federal do Paraná (UFPR); e Rogério Rosa Silva, pesquisador do Museu Paraense Emílio Goeldi. “Quero mostrar para todos, não apenas para os estudiosos, que a formiga é bonita morfologicamente. Ela não é uma praga e ajuda a área de mata. Com essa conscientização, espero que a sociedade ajude a protegê-las também”, diz Morini.

Morini estuda as formigas de serapilheira há mais de uma década e parte das conclusões a que chegou por meio de outros projetos também está no livro Serra do Itapeti: aspectos históricos, sociais e naturalísticos (Canal 6 Editora), organizado por ela e por Vitor Fernandes Oliveira de Miranda, e lançado em 2012.

Os 1.500 exemplares da obra foram distribuídos gratuitamente a instituições de ensino do Alto Tietê e ONGs. Está disponível para download em www.canal6.com.br/site/download. O livro ajuda a fomentar novas discussões sobre o assunto. De acordo com a pesquisadora, os dados sobre biodiversidade que a obra traz estão sendo usados para a criação da Área de Proteção Ambiental (APA) da Serra do Itapeti, na região de Mogi das Cruzes.