sexta-feira, 23 de setembro de 2016

Mutação gera padrão em espiral no pelo de gatos e guepardos

Pelagem dos felinos é definida por alteração genética antes de o animal nascer
ISIS NÓBILE DINIZ | Edição Online 23:33 20 de setembro de 2012

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© GREG BARSH / RESERVA ANN VAN DYK
Mutação determina diferença entre guepardo pintado (esquerda) e sua versão real
Por que alguns gatos de estimação têm manchas escuras em forma de espiral no corpo, no lugar das listras comuns? Mutações em um único gene, o Taqpep, estão por trás da desorganização do padrão da pelagem dos bichanos e também do felino guepardo, segundo estudo publicado na Science sexta-feira (21). Essa alteração genética define o guepardo real, caracterizado por manchas semelhantes às dos gatos com mutação. O trabalho realizado por uma equipe internacional de pesquisadores poderá ajudar a desvendar como as características físicas evoluem nos felinos.
O gene chamado Taqpep, que regula esses padrões de cor no corpo de ambos os felinos, se manifesta – com ou sem mutação – quando o animal ainda está no útero. É aí que o padrão da pelagem começa a se formar. Depois, o gene Edn3 controla a cor do pelo, provavelmente também antes de o animal nascer. Ou seja, o Edn3 induz a produção de pigmento escuro (manchas, pintas e listras) nas áreas preestabelecidas pelo gene Taqpep.
“Até agora, não se conhecia o mecanismo por trás da formação de pintas e listras dos mamíferos”, conta Eduardo Eizirik, um dos autores do estudo e geneticista da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS). “O principal modelo estudado era em camundongos, mas eles não têm listras ou outros tipos de manchas padronizadas”, completa.
De acordo com Eizirik, manter e cruzar grandes animais selvagens listrados ou pintados, como zebras ou girafas, é uma das dificuldades desse tipo de estudo. “O gato pode ser um excelente modelo nesse caso”, afirma o geneticista. Para chegar a esse resultado, foram necessários mais de dez anos de trabalhos cruzando gatos, investigando a genética desses animais e comparando com o que observavam em camundongos e outros organismos.
O achado abre caminho para, futuramente, entender com mais detalhe como essas mudanças ocorrem no nível molecular, bem como os processos evolutivos que influenciam a sua formação. “Ainda não se sabe ao certo por que os animais têm cores diferentes e quais as vantagens e desvantagens dos tipos de pelagem”, explica Eizirik. Do ponto de vista evolutivo, o estudo poderá permitir a verificação de como as listras ou manchas, importantes para camuflagem no ambiente, podem favorecer ou desfavorecer a adaptação das espécies.
A partir desses resultados, os pesquisadores criaram um modelo para tentar explicar o desenvolvimento dos padrões de pelagem e cor de gatos domésticos e selvagens, que deve ser usado para investigar o que altera o tamanho das marcas tigradas durante o crescimento dos animais.

Pesca pré-histórica

Ameríndios capturavam tubarões e corvinas, talvez de forma excessiva, 5 mil anos atrás na costa do Rio de Janeiro
MARCOS PIVETTA | ED. 247 | SETEMBRO 2016

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Sambaqui_247A costa brasileira apresenta mais de 2 mil sambaquis conhecidos, um tipo de vestígio arqueológico que remete às práticas funerárias e à dieta dos primeiros habitantes do litoral. Em tupi, sambaqui quer dizer amontoado de conchas. Pescadores-coletores pré-históricos, que ocuparam as margens do Atlântico, enterravam seus mortos em covas rasas, recobertas por conchas e restos de peixes, acompanhadas de artefatos de pedra e de osso. Com o tempo, os lugares mais usados para sepultamentos acumularam grande quantidade de materiais e formaram montes, alguns com até 30 metros (m) de altura, como se verifica em sítios arqueológicos de Santa Catarina. Segundo um estudo feito por pesquisadores do Rio de Janeiro, de São Paulo e do Rio Grande do Sul, a pesca conduzida pelos ameríndios em trechos do litoral fluminense, cujos vestígios se encontram registrados nos sambaquis, pode ter representado a primeira ameaça significativa aos estoques naturais de certos peixes, como corvinas e tubarões.
Os autores do trabalho examinaram mais de 6 mil fragmentos ósseos, dentes e otólitos (cálculos calcários formados no ouvido interno) de peixes encontrados em 13 sambaquis da costa do Rio de Janeiro. Os sítios se localizam entre as baías da Ilha Grande, em Angra dos Reis, e da Ilha do Cabo Frio, em Arraial do Cabo, com idade de 5.600 a 700 anos (ver mapa). A análise desse material, que faz parte do acervo arqueológico do Museu Nacional da Universidade Federal do Rio de Janeiro (MN-UFRJ), levou-os a ter uma ideia aproximada da quantidade e do tamanho dos exemplares capturados ao longo de alguns milhares de anos. Também serviu de base para concluírem que a captura de peixes era uma atividade muito desenvolvida e diversificada antes da chegada dos europeus ao Brasil. No acervo, foram identificadas 97 espécies de peixe. “Esse número representa 37% de todas as espécies de peixe registradas até hoje naquele trecho do litoral fluminense”, comenta o paleontólogo marinho Orangel Aguilera, da Universidade Federal Fluminense (UFF), de Niterói, coordenador do estudo, publicado em 29 de julho no periódico Plos One. “Os sambaquieiros realmente dominavam a arte da pesca.”
© ELIAS LEVY / FLICKR
Tubarão-branco: umas das mais de 20 espécies desses peixes que os povos dos sambaquis pescavam
Tubarão-branco: umas das mais de 20 espécies desses peixes que os povos dos sambaquis pescavam
As características do registro arqueológico de algumas espécies marinhas comumente encontradas em sambaquis indicam que certos tipos de peixe teriam sido capturados em excesso ou na forma de exemplares muito jovens, pescados, às vezes, em áreas que funcionavam como berçários desses animais. Essa prática teria inaugurado o processo de vulnerabilidade ou até de diminuição das populações costeiras de alguns peixes. Segundo Aguilera, os povos concheiros, também denominados sambaquieiros, pescavam em distintos ambientes marinhos, rasos e mais profundos, desde praias arenosas coladas à costa até o leito rochoso do oceano repleto de peixes. Apesar de haver registros arqueológicos de que o homem pesca há pelo menos 40 mil anos, existem poucos estudos sobre eventuais impactos ambientais da captura de peixes na pré-história. Um raro trabalho, feito em 2010 pelo Centro de Investigaciones Pesqueras de Cuba, sugere até que os ameríndios não disporiam da tecnologia necessária para explorar a maior parte dos estoques de seres marinhos do Caribe — conclusão agora refutada pelo pesquisador da UFF.
Os vestígios marinhos recuperados nos sambaquis fluminenses atestam que a pesca era uma atividade dominante naquela região. A espécie com maior número de registros, e provavelmente a mais intensamente capturada pelos pescadores-coletores do litoral fluminense, é a corvina (Micropogonias furnieri). Foram estudados 5.532 otólitos da espécie, que habita fundos lodosos e arenosos de águas costeiras ou de estuários e pode chegar a 70 centímetros (cm) de comprimento. “A corvina é atualmente a segunda espécie mais pescada no litoral brasileiro, atrás apenas da sardinha”, informa o oceanógrafo Acácio Tomás, pesquisador do Instituto de Pesca de Santos, coautor do estudo. “Os povos ancestrais também devem ter pescado sardinhas, mas infelizmente não temos registros da espécie no material coletado nos sambaquis fluminenses”, explica Tomás. Onze dos 13 sítios arqueológicos estudados apresentavam vestígios deM. furnieri. A ubiquidade da espécie nos sambaquis possibilitou estimar o impacto causado pela pesca nos estoques de corvina nos últimos 5 mil anos. Segundo os cálculos dos pesquisadores, houve uma redução de 28% no tamanho médio das corvinas desde aquela época até hoje, em razão da exploração continuada da espécie.
Sambaqui_Mapa_247A presença marcante de vestígios de tubarões adultos e de filhotes, sobretudo de algumas espécies de ocorrência oceânica (longe da costa), também chamou a atenção de Aguilera e seus colaboradores. Eles examinaram 660 vértebras fossilizadas, além de dentes e ossos do crânio, de mais de 20 espécies diferentes desse peixe, como o tubarão-branco (Carcharodon carcharias), a mangona (Carcharias taurus), o tubarão-tigre (Galeocerdo cuvier) e o tubarão-martelo (Sphyrna lewini). A abundância de registros é interpretada pelos autores do trabalho como um indício de que as populações dos sambaquis tinham uma grande capacidade de pesca.
De acordo com estimativas dos pesquisadores, os ossos estudados pertenceram a exemplares cujo comprimento variava de 30 cm, no caso de filhotes, a 2,5 m, entre os espécimes maduros. Os tubarões capturados pelos sambaquieiros eram quase sempre menores do que o tamanho médio estimado atualmente para essas mesmas espécies, consideradas hoje vulneráveis ou em risco de extinção. Eles provavelmente são fruto de uma pesca excessiva em áreas de berçário, importante para a manutenção da capacidade reprodutiva dos animais. Entre os resquícios de arraias presentes nos sambaquis, os mais abundantes foram da arraia-pintada (Aetobatus narinari).
© CLÁUDIO D. TIMM / WIKIPEDIA
Corvina: espécie era a mais pescada entre os sambaquieiros fluminenses
Corvina: espécie era a mais pescada entre os sambaquieiros fluminenses
Canoas e redes de pesca?A localização dos sítios arqueológicos é um indicador de que os ameríndios não se instalaram por acaso nessas latitudes. Os 13 sambaquis se espalham por uma faixa de cerca de 270 quilômetros do litoral fluminense conhecida por ser uma área de ressurgência, em que águas mais profundas, ricas em nutrientes, afloram. Nos pontos do litoral onde ocorre esse fenômeno oceanográfico tende a haver maiores concentrações de peixes. “Os sambaquieiros eram grandes coletores de mariscos, mas esse alimento não era suficiente para alimentá-los. Eram os peixes que basicamente os sustentavam”, diz a arqueóloga Tania Andrade Lima, do MN-UFRJ, outra coautora do estudo. “Eles conheciam bem o ambiente marinho e pescavam tanto na costa como perto do alto-mar.” Além de serem a base da dieta dos sambaquieiros, os seres marinhos capturados também podiam ser usados em rituais funerários, como as conchas enterradas com os mortos, ou na confecção de objetos decorativos. Dentes de tubarão eram perfurados e usados como peças de colares, um tipo de adorno comumente encontrado em sambaquis.
Embora todos os sambaquis analisados no estudo se situem sob a influência de uma zona de ressurgência, os sítios podem ser agrupados de acordo com algumas particularidades geográficas. O sambaqui de Acaiá se situa na Ilha Grande. Os sítios do Algodão, Major, Bigode, Caieira e Peri ficam em ilhotas ou em áreas costeiras rochosas da baía do Ribeira, em Angra dos Reis. Camboinhas se encontra em uma planície arenosa costeira dominada por lagoas na região oceânica de Niterói. Os sambaquis de Saquarema, Beirada, Manitiba e Ponte do Girau ocupam uma parte da planície arenosa, também pontuada por lagoas costeiras, da região de Saquarema. Por fim, a Ilha do Cabo Frio, no município de Arraial do Cabo, abriga dois sítios: Usiminas, em um assentamento rochoso, e o homônimo Ilha do Cabo Frio, em área de dunas.
© LOPES ET AL. 2016. PLOS ONE.
Dentes de tubarão: usados como adorno de colar
Dentes de tubarão: usados como adorno de colar
Para explorar essa diversidade de ambientes marinhos, os pesquisadores sustentam a hipótese de que os povos do passado desenvolveram estratégias e ferramentas de pesca. A captura de seres marinhos se beneficiava provavelmente do emprego de linhas e redes de espera (emalhe) feitas de fibras vegetais, anzóis e arpões confeccionados com ossos de animais. A busca por espécies que viviam longe da costa ou por ilhas estratégicas para a pesca em mar aberto requeria o emprego de alguma forma de embarcação. “Não temos registros arqueológicos de canoas ou redes, que eram feitas de madeira e fibras vegetais que não se preservam com o tempo”, explica Aguilera, que contou com o apoio de duas alunas da pós-graduação da UFF na produção do artigo, Mariana Lopes e Thayse Bertucci. No entanto, há evidências indiretas de que os ameríndios eram bons de pesca: projéteis feitos de ossos, encontrados em sambaquis, parecem ter sido usados para dar o golpe final em espécimes de grande porte; artefatos de pedra, também presentes em alguns sítios, podem ter sido empregados na confecção de canoas.
Estudioso dos sambaquis da costa brasileira, em especial os de Santa Catarina, o arqueólogo Paulo DeBlasis, do Museu de Arqueologia e Etnologia da Universidade de São Paulo (MAE-USP), elogia o trabalho de Aguilera e seus colegas. “O artigo adota uma abordagem muito interessante sobre a relação dos sambaquieiros com a pesca marinha”, afirma. Segundo o arqueólogo do MAE, ainda hoje alguns pesquisadores mais tradicionalistas acreditam que, devido à abundância de conchas nos sambaquis, a base da dieta dos habitantes pré-históricos do litoral eram frutos do mar. “Em Santa Catarina, também há sítios arqueológicos em ilhas. Há tempos, temos a percepção de que eles eram grandes pescadores, além de caçar mamíferos marinhos e terrestres.”
© LOPES ET AL. 2016. PLOS ONE.
Vestígios de outros peixes dos sambaquis fluminenses: mais de 6 mil peças foram analisadas
Vestígios de outros peixes dos sambaquis fluminenses: mais de 6 mil peças foram analisadas
Não se sabe até que ponto plantas e cultivos agrícolas também fizeram parte do cardápio dos ameríndios da beira-mar. Cinco anos atrás, a bioantropóloga Sabine Eggers, do Instituto de Biociências (IB) da USP, reconstituiu a dieta de Luzio, um ameríndio que habitou há aproximadamente 10 mil anos em um sambaqui de rio do Vale do Ribeira (SP), distante cerca de 100 quilômetros da costa atual. O resultado do estudo foi surpreendente: Luzio comia carne de caça, tubérculos, frutas e quase nenhum peixe ou crustáceo, seja de água doce ou marinha. Mas, a julgar pelo novo trabalho feito com material dos sambaquis do Rio de Janeiro, os povos antigos da costa fluminense gostavam mesmo era de um bom pescado.
Artigo científico

Os povos de Lagoa Santa

Sepultamentos humanos em Minas Gerais revelam uma sucessão de costumes entre 10 mil e 8 mil anos atrás
MARIA GUIMARÃES | ED. 247 | SETEMBRO 2016

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© MAURICIO DE PAIVA
Um abrigo em meio ao Cerrado, Lapa do Santo parece ter sido um importante centro de rituais ligados à morte
Um abrigo em meio ao Cerrado, a Lapa do Santo parece ter sido um importante centro de rituais ligados à morte
Uma abertura na face de um penhasco em meio ao Cerrado na região de Lagoa Santa, Minas Gerais, tem revelado surpresas a arqueólogos, biólogos e antropólogos. Essa caverna, a Lapa do Santo, já foi um importante centro de rituais ligados à morte, como revelam escavações descritas em artigo em processo de publicação na revista Antiquity, uma das mais prestigiadas da área. Padrões de sepultamento complexos, com desmembramento de corpos e disposição seguindo regras precisas, revelam uma sucessão de culturas muito distintas em um período que se considerava homogêneo, por volta de 10 mil anos atrás. “O maior mérito foi enxergar essas transformações culturais ao longo do tempo, que por algum motivo ninguém tinha percebido”, avalia o arqueólogo brasileiro André Strauss, professor visitante na Universidade de Tübingen e doutorando no Instituto Max Planck, ambos na Alemanha, autor principal do artigo. O estudo vai além da morte e permite uma espiadela em como viviam e quem eram essas pessoas.
Strauss sentiu que ali havia algo especial no primeiro ano do curso de geologia na Universidade de São Paulo (USP), quando teve sua primeira expedição de campo como estagiário do bioantropólogo Walter Neves, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP), em 2005. “Eu ficava no fundo de uma trincheira de 2 metros de profundidade, cavando e peneirando o que encontrava.” Foi desse posto que Strauss se encantou com o que havia por descobrir ali e queria fazer algo diferente de se concentrar na medição de crânios e na busca por indícios de coexistência com grandes animais, a megafauna. Esse era o foco das pesquisas realizadas ainda no século XIX, quando o naturalista dinamarquês Peter Lund descobriu ossos humanos associados aos de grandes animais numa caverna de Lagoa Santa e iniciou uma tradição de escavação no que se tornou uma das mais longevas regiões arqueológicas no país. Cinco anos depois, já no mestrado sob a orientação de Neves, Strauss viu que havia alguma ordem na confusão aparente do sítio: o que parecia uma mistura de ossos sem sentido na verdade seguia um padrão. “É difícil perceber as sutilezas, os sepultamentos são muito complexos.”
Arqueologia_Mapa_247“Isso foi possível porque o Walter inverteu a ordem habitual dos procedimentos de campo”, afirma Strauss. A arqueologia brasileira, segundo ele, concentra-se em artefatos, de maneira geral, e apenas chama especialistas em fósseis humanos quando ossos são encontrados. “Muitos esqueletos são danificados no processo.” Nos projetos de Neves, que desde 1988 analisa a evolução humana na América, com estudo de caso nessa região, são os bioantropólogos que coordenam a escavação e documentam tudo o que aparece, com especialistas para analisar os artefatos – na Lapa do Santo, lascas de pedra e ferramentas de osso como espátulas, buris e (raramente) anzóis.
Nessa caverna, onde há paredes decoradas com desenhos em relevo que indicam rituais de fertilidade (imagens fálicas), o resultado foi marcante. Strauss, Neves e colegas identificaram três períodos distintos de ocupação humana, o mais antigo entre 12,7 mil e 11,7 mil anos atrás. Entre 2001 e 2009, foram exumados e analisados 26 sepultamentos humanos ocorridos aproximadamente entre 10.500 e 8 mil anos atrás que revelam práticas mortuárias altamente variáveis e nunca antes descobertas nas terras baixas da América do Sul, descritas no artigo da Antiquity e em outro assinado apenas por André Strauss, publicado na edição de janeiro-abril do Boletim do Museu Paraense Emílio Goeldi.
“Existiram práticas funerárias altamente sofisticadas nos Andes”, conta Neves, “mas as múmias chilenas já estudadas são mais recentes do que o material da Lapa do Santo”. Outra distinção é que na caverna mineira não há oferendas mortuárias, enquanto a prática habitual de caçadores-coletores era sepultar os mortos acompanhados ao menos de seus pertences. “A complexidade das práticas da Lapa do Santo não reside nos objetos, mas numa alta manipulação do corpo e do esqueleto de maneira muito sofisticada”, afirma o professor da USP.
Arqueologia_247
Rituais de morte
O padrão de sepultamento mais antigo, datado entre 10.600 e 9.700 anos atrás, foi descrito com base em um homem e uma criança de cerca de 5 anos, ambos enterrados inteiros. A criança foi posta sentada, com as pernas dobradas e os joelhos próximos à cabeça. A mandíbula afastada, como se a boca estivesse aberta, indica que a cova não foi completamente preenchida.
A remoção de partes dos cadáveres em seguida à morte caracteriza o período seguinte, entre 9.600 e 9.400 anos atrás. Representado por sete sepultamentos, mais alguns ossos avulsos, esse conjunto ficou descrito como o segundo padrão. Alguns dos esqueletos estavam articulados, mas com partes faltando. Um caso marcante foi o de um homem cuja cabeça parece ter sido removida horas depois da morte e enterrada com as duas mãos (também decepadas, como atestam marcas de corte em ossos do punho) cobrindo o rosto – uma voltada para cima e outra para baixo, como Strauss e colaboradores descreveram em 2015 na revista PLoS One.
Outros esqueletos estavam completamente desmembrados e arrumados em fardos, indicando que os ossos foram armazenados juntos, talvez embrulhados, e enterrados apenas depois de descarnados e secos. Muitos dos ossos isolados também passaram por alterações como queima, cortes, aplicação de pigmento vermelho e remoção dos dentes. Em alguns casos, eram combinados ossos de criança (uma ou duas) com o crânio de um adulto, ou vice-versa, de uma maneira que sugere regras muito precisas de como esse sepultamento deveria acontecer. Dentes removidos também eram sepultados com os restos mortais de outra pessoa.
© MAURICIO DE PAIVA
Crânio com dentes removidos ...
Crânio com dentes removidos
O terceiro padrão de sepultamento, datado entre 8.600 e 8.200 anos atrás, envolve nove ossadas dispostas completamente desarticuladas em covas circulares (entre 30 e 40 centímetros de diâmetro) e apenas 20 centímetros de profundidade. Cada cova, preenchida por inteiro, abrigava um único indivíduo. No caso dos adultos, os ossos mais longos em geral eram quebrados após a morte e só assim cabiam nas exíguas tumbas.
Mesmo em meio a tantos desmembramentos, não há indícios de que a violência em vida fosse uma prática corrente. “Nós lemos os ossos, tudo fica registrado neles”, conta Strauss. E eles guardam níveis muito baixos de fraturas recompostas, que indicariam terem acontecido em vida. De maneira geral, Strauss considera que os achados representam uma mudança no paradigma de como se vê a habitação humana por ali nesse período, o início do Holoceno. “Por muito tempo a grande questão era se a Luzia era a mais antiga da América e se era parecida com africanos”, afirma, referindo-se ao crânio de 11 mil anos descrito por Neves e que redefiniu como se deveria pensar a ocupação humana dessa região. “Agora sabemos que não houve um povo de Luzia em Lagoa Santa; foi uma sucessão de povos que habitaram a região com transformações culturais muito claras.” Afinal, trata-se de um período de cerca de 5 mil anos, tempo suficiente para povoamentos muito diversos, mesmo que fossem até certo ponto descendentes uns dos outros.
Estudos com DNA devem em breve começar a render resultados e trazer algumas respostas sobre como esses grupos se sucederam e qual o parentesco entre eles. “A morfologia craniana mostra que eles tinham a mesma ‘arquitetura’ geral”, conta Walter Neves. Há uma variação contínua nesse grande grupo que ele define como paleoamericano. De acordo com sua teoria, de que duas migrações distintas deram origem aos habitantes da América, as primeiras pessoas com características asiáticas teriam chegado por ali há cerca de 7 mil anos – e não há resquícios humanos em Lagoa Santa datados entre 7 mil e 2 mil anos atrás. Mesmo assim, o que há de indícios de lá e de outros lugares aos poucos vem refinando a hipótese. “Eu achava que a segunda leva migratória teria substituído o povo de Luzia”, admite. “Mas hoje temos evidências muito fortes de que aquela morfologia sobreviveu praticamente intacta até o século XIX.” É o caso, por exemplo, dos índios Botocudos (que foram dizimados no período colonial), de acordo com crânios armazenados no Museu Nacional do Rio de Janeiro, como defendem Strauss, Neves e colegas em artigo publicado em 2015 na revista American Journal of Physical Anthropology.
© MAURICIO DE PAIVA
...anzóis feitos de osso ...
Anzóis feitos de osso
Práticas de vida
Desde o início do doutorado, em 2011, Strauss coordena os trabalhos na Lapa do Santo, com financiamento alemão. A riqueza arqueológica garante o interesse da colaboração pelos dois países, que inclui parcerias para estudos genéticos. A contrapartida brasileira no projeto é Walter Neves, e seu Laboratório de Estudos Evolutivos e Ecológicos Humanos (LEEEH) recebe todo o material coletado nas expedições. Nos últimos anos, não foram encontrados vestígios de cerâmica no local, um indício forte de que eram populações de caçadores-coletores que moravam ali uma parte do tempo, e não agricultores, corroborando o que já se acreditava. Os animais caçados eram peixes, lagartos, roedores, tatus, porcos selvagens e pequenos cervos, todos carregados inteiros para a caverna. Nada de bichos um pouco maiores, como antas, e dos imensos mamíferos representantes da megafauna, que se acreditava associada aos humanos de Lagoa Santa desde que Peter Lund encontrou essa associação em outra caverna da região, entre 1835 e 1844. Nem sempre, pelo jeito.
“Eles comiam até mocó”, exclama Neves, referindo-se ao roedor pouco maior do que um porquinho-da-índia. Para ele, não há nada mais precário do que incluir esses animais na dieta, indicação de que os grupos de Lagoa Santa não tinham melhores fontes de proteína à disposição e viviam numa situação limite para garantir a subsistência. É uma teoria apenas, mas a escassez de pertences nos sepultamentos pode ser sinal de que não havia espaço para desperdício, e as ferramentas – como anzóis, de que só foram encontrados sete na Lapa do Santo – eram necessárias aos vivos. “O tempo deles era dedicado a viabilizar a existência do grupo”, especula Neves. E eram grandes grupos, estima ele.
© ANDRÉ STRAUSS/UNIVERSIDADE DE TÜBINGEN
Rodrigo Elias de Oliveira trabalha na exumação do crânio decapitado
Rodrigo Elias de Oliveira trabalha na exumação de crânio decapitado…
O modo de vida pode estar agora mais definido, mas a conclusão também propõe um enigma: análises químicas que refletem a dieta por meio da quantificação de isótopos de carbono e nitrogênio, feitas pelo biólogo brasileiro Tiago Hermenegildo como parte do doutorado na Universidade de Cambridge, na Inglaterra, mostraram que os habitantes da região comiam muitos vegetais e complementavam a dieta com caça. Esse alto grau de consumo de vegetais é inesperado para caçadores-coletores, sobretudo com a dieta rica em carboidratos indicada pelas frequentes cáries nos dentes encontrados.
O dentista Rodrigo Elias de Oliveira, pesquisador do grupo de Neves, é coautor de um artigo liderado por Pedro Tótora da Glória, também do LEEEH, sobre a saúde dental na Lapa do Santo, a ser publicado na revista Annals of the Brazilian Academy of Sciences. Parceiro de Strauss desde 2006 nas escavações da Lapa do Santo, Elias explica as discrepâncias entre a incidência de cáries que tem observado e a documentada para outras populações de caçadores-coletores por ser Lagoa Santa uma região de clima tropical, com vegetação de Cerrado. “Os outros exemplos que temos são de climas temperados”, compara. “Aqui os alimentos naturalmente disponíveis – muitas frutas e tubérculos – podem gerar mais cáries.” Ele aposta no pequi e no jatobá, muito usados até hoje na região, como uma fonte alimentar já naquele tempo. São frutos ricos em carboidratos e fragmentos carbonizados foram encontrados nos sítios de Lagoa Santa.
Elias, que fez doutorado com Walter Neves e agora realiza estágio de pós-doutorado em periodontia na Faculdade de Odontologia da USP, traz ao projeto um detalhamento no estudo dos dentes, cujo material mais resistente do que os ossos os torna abundantes em sítios arqueológicos. “O dente é como uma cápsula, acaba virando nosso cofrinho”, afirma. Ele explica que os ossos se renovam constantemente, a ponto de se dizer que a cada 10 anos uma pessoa substitui seu esqueleto por inteiro. Os dentes de um adulto, no entanto, são testemunho do período da vida em que se formam os dentes permanentes. Ele espera que estudos com isótopos, em andamento agora em colaboração com Hermenegildo, ajudem a aprofundar aspectos da dieta até o detalhe de que tipos de planta comiam, de migrações ao longo da vida, de quanto tempo as crianças eram alimentadas com leite materno. O dentista adianta que isótopos de estrôncio, assim como o formato do fêmur, que responde à ação da musculatura, indicam que as pessoas encontradas na Lapa do Santo eram nativas de Lagoa Santa. “Eles tinham mobilidade, mas não eram errantes.”
© MAURICIO DE PAIVA
... e analisa ossadas no LEEH
… e analisa ossadas no LEEEH
Chão de cinzas
A inferência de intensa ocupação humana vem da confirmação de que muitas fogueiras foram acesas na Lapa do Santo. “Eles usavam fogo o tempo todo, sabiam o que estavam fazendo”, afirma a arqueóloga Ximena Villagran, do Museu de Arqueologia e Etnologia (MAE) da USP. Ela fez análises ao microscópio do sedimento da caverna e mostrou uma grande quantidade de cinzas até uma profundidade de 1 metro, conforme mostra em artigo publicado em julho no site da revista Journal of Archaeological Science. Mais do que controlar o fogo, os habitantes da região aparentemente planejavam seu uso, armazenando madeira em processo de decomposição. Esse nível de detalhe é possível graças a análises de petrologia orgânica, uma técnica que recentemente passou a ser usada em arqueologia, à qual Ximena teve acesso por meio da parceria com o geólogo francês Bertrand Ligouis durante estágio de pós-doutorado na Universidade de Tübingen, onde ele dirige o Laboratório de Petrologia Orgânica Aplicada.
Outra técnica de ponta usada por ela foi a Espectrometria de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), normalmente usada para analisar sedimento solto. Ximena dispôs suas amostras em lâminas de vidro, de maneira que conseguia investigar com precisão por que o sedimento é composto por agregados de vários tons de amarelo, laranja e vermelho. Ao caracterizar o sedimento dentro da caverna e em torno dela, ficou claro que a produção de cinzas acontecia dentro do abrigo. Ela também identificou fragmentos de cupinzeiros, indicando que por algum motivo o material era trazido para dentro da caverna. “Talvez eles os usassem como pedras quentes para cozinhar ou como forno do lado de fora, como os xavantes usam para fazer seu bolo de milho”, especula. Depois da revelação na escala microscópica, passou a dar-se conta de que os campos de Lagoa Santa são repletos de cupinzeiros.
Um enigma surgiu ao verificar que a coloração vermelho-escura que observava em certas partes do sedimento teria exigido altas temperaturas, mais de 600 graus Celsius (°C). Em experimentos nos quais acendia fogueiras e inseria nas chamas um termômetro de cabo bem longo, Ximena verificou que o solo embaixo do fogo não era sujeito a tão altas temperaturas. A explicação literalmente lhe caiu na cabeça na segunda vez em que visitou o sítio arqueológico. “Percebi que uma chuva de sedimento cai do paredão de rocha acima da entrada da caverna”, conta. Se caíssem diretamente sobre uma fogueira, essas partículas encontrariam temperaturas entre 800 °C e 1000 °C.
© ADRIANO GAMBARINI
André Strauss em sua mesa de trabalho na Lapa do Santo
André Strauss em sua mesa de trabalho na Lapa do Santo
Ao analisar a microestrutura do sedimento em torno dos sepultamentos, Ximena percebeu uma continuidade perturbada em certos pontos, como se alguém tivesse cavado para fazer uma cova. Ela pretende continuar as análises para detalhar como os sepultamentos eram feitos. Strauss também quer saber se as práticas funerárias sofisticadas só existiam na Lapa do Santo: ele aposta que era uma cultura mais disseminada. “Fui olhar as publicações passadas e os sinais estão lá, faltou analisar dessa maneira”, afirma o arqueólogo, que quer ampliar os estudos para outras regiões do país.
Uma limitação é que o que já foi escavado não pode ser recuperado, a não ser que a documentação tenha sido extremamente meticulosa. E até recentemente os registros eram falhos, até por falta de recursos. “Fazer uma escavação é como ler um livro e queimar as páginas”, compara Strauss, que se especializou em documentação arqueológica. Ele conta que retirar um sepultamento leva de 20 a 25 dias, nos quais o sedimento é retirado aos poucos enquanto se gera um modelo tridimensional dos achados e registra-se tudo com fotos e vídeo. As cadernetas de campo dos arqueólogos, segundo ele, devem trazer as informações e observações detalhadamente e serem públicas: nada de diário pessoal. “Essa percepção ainda está crescendo na arqueologia brasileira.”
De 2011 para cá mais 11 sepultamentos foram exumados, corroborando os padrões descritos anteriormente, e estão em processo de estudo. As escavações continuam na Lapa do Santo e prometem revelar ainda outras camadas de tempo e costumes. De acordo com o arqueólogo norte-americano Kurt Rademaker, professor na Universidade do Norte de Illinois e especialista em caçadores-coletores, o trabalho em Lagoa Santa está se somando ao que é feito na região dos Andes em revelar uma grande diversidade cultural. “Strauss e sua equipe interdisciplinar estão fazendo ciência arqueológica de ponta e enriquecendo nosso conhecimento sobre a aparência física, a ancestralidade e os modos de vida dos sul-americanos antigos, em particular suas interessantíssimas práticas rituais”, afirma. É impossível saber o que se passava na cabeça desses antigos habitantes do que hoje é Minas Gerais, mas a equipe envolvida nos estudos está empenhada em construir um retrato aproximado.
Projeto
Origens e microevolução do homem na América: Uma abordagem paleoantropológica (III) (nº 2004/01321-6); Modalidade Auxílio à Pesquisa – Temático; Pesquisador responsável Walter Alves Neves (IB-USP); Investimento R$ 2.032.930,19.
Artigos científicos

STRAUSS, A. et al. Early Holocene funerary complexity in South America: The archaeological record of Lapa do Santo (east-central Brazil). Antiquity. No prelo.

DA-GLORIA, P. J. T. et al. Dental caries at Lapa do Santo, central-eastern Brazil: An Early Holocene archaeological site. Annals of the Brazilian Academy of Sciences. No prelo.

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Molecular assessment of the phylogeny and biogeography of a recently diversified endemic group of South American canids (Mammalia: Carnivora: Canidae)

Ligia Tchaicka1  , Thales Renato Ochotorena de Freitas2  , Alex Bager3  , Stela Luengos Vidal4  , Mauro Lucherini4  , Agustín Iriarte5  , Andres Novaro6  , Eli Geffen7  , Fabricio Silva Garcez8  , Warren E. Johnson9  , Robert K. Wayne10  , Eduardo Eizirik8  11 
1Departamento de Química e Biologia, Centro de Educação, Ciências Exatas e Naturais (CECEN), Universidade Estadual do Maranhão (UEMA), São Luís, MA, Brazil
2Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS, Brazil
3Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA), Lavras, MG, Brazil
4Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca, Argentina
5Center for Advanced Studies in Ecology & Biodiversity (CASEB), Pontificia Universidad Catolica & Fundacion Biodiversitas, Santiago, Chile
6Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, and Wildlife Conservation Society-Argentina, Junín de los Andes, Neuquén, Argentina
7Department of Zoology, Tel Aviv University, Israel
8Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), Porto Alegre, RS, Brazil
9Smithsonian Conservation Biology Institute, Washington, DC, USA
10Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, CA, USA
11Instituto Pró-Carnívoros, Atibaia, SP, Brazil
To investigate the evolution and biogeography of an endemic group of South American foxes, we examined mitochondrial DNA control region sequences for 118 individuals belonging to all six extant species of the genusLycalopex. Phylogenetic and molecular dating analyses supported the inference that this genus has undergone a very recent and rapid radiation, stemming from a common ancestor that lived ca. 1 million years ago. The Brazilian endemic L. vetulus was supported as the most basal species in this genus, whereas the most internal group is comprised by the recently diverged (ca. 350,000 years ago) Andean/Patagonian species L. griseus and L. culpaeus. We discuss the inferred phylogenetic relationships and divergence times in the context of the current geographic distributions of these species, and the likely effects of Pleistocene climatic changes on the biogeography of this group. Furthermore, a remarkable finding was the identification of multiple individuals classified as L. gymnocercusbearing mtDNA haplotypes clearly belonging to L. griseus, sampled in regions where the latter is not known to occur. At a minimum, this result implies the need to clarify the present-day geographic distribution of each of these fox species, while it may also indicate an ongoing hybridization process between them. Future testing of this hypothesis with in-depth analyses of these populations is thus a priority for understanding the history, evolutionary dynamics and present-day composition of this endemic Neotropical genus.
Key words: Mitochondrial DNA control region; Lycalopex; Canidae; Carnivora
INTRODUCTION
The first representatives of the family Canidae entered South America in the late Pliocene and early Pleistocene, coming from North America through the Panama Isthmus (formed approximately 3 million years ago [mya]), and then radiated to achieve their present diversity (Berta, 1987). Currently there are ten canid species endemic to South America, representing the largest diversity of this family on any continent. This diversity has been attributed to their generalist and opportunistic feeding strategies that utilize vertebrate prey as well as fruits and invertebrates, and their adaptation to a wide variety of habitats (Berta, 1987Ginsberg and MacDonald, 1990;Wozencraft, 2005).

Of the ten living species of South American canids, eight are often referred to as foxes, and recognized as a monophyletic assemblage comprising the genera Cerdocyon, Lycalopex, and Atelocynus (Wayne et al., 1997Zrzavy and Ricankova, 2004Slater et al., 2009Perini et al., 2010Prevosti, 2009). These species have similar karyotypes, suggesting a recent divergence (2n=74; NF=76 - A. microtis, L. gymnocercus, L. griseus, L. culpaeus, L. sechurae, L. gymnocercus and L. vetulus; 2n = 74; NF=106 - Cerdocyon thous [Brum-Zorrila and Langguth, 1980;Wayne et al., 1987Wayne, 1993]). Although several previous studies have addressed the evolutionary relationships among these foxes using morphological and/or molecular data (e.g.Wayne et al., 1997Lyras and Van Der Geer, 2003;Zrzavy and Ricancova, 2004Bardeleben et al., 2005Lindblad-Toh et al., 2005Prevosti, 2009Slater et al., 2009Perini et al., 2010), the resolution of their phylogeny remains elusive, especially with regard to the species belonging to the genus Lycalopex (including Pseudalopex – see below). These canids will be treated here as Lycalopex vetulus(hoary fox), L. gymnocercus (pampas fox), L. culpaeus (culpeo), L. fulvipes (Darwin's fox), L. griseus (chilla) and L. sechurae (Sechuran fox), following Wozencraft (2005).

Furthermore, the precise geographic range of these species is still not known in full detail, although some broad distributional patterns are well documented (Figure 1). L. culpaeus is distributed along the Andes and hilly regions of western South America, from southern Colombia to Tierra del Fuego. L. fulvipes is endemic to costal Chile. L. griseus is widespread in areas of plains and mountains on both sides of the Andes, from northern Chile south to the Strait of Magellan (introduced by humans into the island of Tierra del Fuego in 1953). L. gymnocercus is currently thought to range from eastern Bolivia and western Paraguay to central Argentina and southern Brazil. L. sechurae occurs on the Pacific coast of Peru and Ecuador. Finally, L. vetulus is endemic to the Cerrado biome and adjacent areas in central Brazil (Sillero-Zubiri et al., 2004).
Figure 1 Maps showing the current geographic distribution of Lycalopex species (modified from Courtenay and Maffei (2004) and approximate sample collection sites. Triangles in panel B indicate sampling localities of individuals initially labeled as L. gymnocercus, but whose mtDNA haplotypes group within the L. griseus clade. Individuals with unknown geographic origin were not included in the map (see Table S1 for more details). 
Several taxonomic schemes for these species have been suggested based on different methods. Langguth (1975), based on ecological and morphological data, suggested two taxa: (i) genus Lycalopex Burmeister, 1854 and (ii)Pseudalopex Burmeister, 1856 as a subgenus of Canis. The former contained only Lycalopex vetulus, the type species for this genus, while the latter contained Canis (PseudalopexculpaeusC. (P.) gymnocercusC. (P.)griseus and C. (P.) sechurae. Subsequently, Clutton-Brock et al. (1976), using morphological and behavioral data, included all these species in the genus Dusicyon C. E. H. Smith, 1839, originally proposed for the now extinct Falkland Island "wolf", Daustralis (Wozencraft, 2005). Berta (1987), based on the fossil record and cladistic analyses of morphological data, proposed that the genus Pseudalopex should include P. griseus, P. gymnocercus, P. culpaeus, P. vetulusP. sechurae and the extinct species P. peruanus. Subsequently, Zunino et al. (1995) grouped P. gymnocercus and P. griseus into a single species, Lycalopex gymnocercus, supporting the use of Lycalopex as the generic name for L. culpaeus, L. vetulus and L. sechurae (L. fulvipes was also considered to be a synonym of L. gymnocercus in that study).
Additional classifications of this group have been suggested (Thomas, 1914Kraglievich, 1930Cabrera, 1931Osgood, 1934Hough, 1948Thenius, 1954Van Gelder, 1978), illustrating the ongoing taxonomic instability in this Neotropical clade throughout the 20th century. Ultimately, this confusion is a reflection of the underlying uncertainty regarding the species limits and phylogenetic relationships among these foxes, highlighting the need for additional work focusing on this group. Recent analyses (e.g.Prevosti, 2009Slater et al., 2009Perini et al., 2010;Prevosti et al., 2013) have contributed to this debate by exploring larger data sets composed of molecular and/or morphological characters, but still have not conclusively settled these relationships, illustrating the difficulty in achieving a robust phylogeny for this group.

Mitochondrial DNA (mtDNA) segments are useful in evolutionary studies of recent divergence processes in animals, due to their relatively high substitution rate, maternal inheritance, and absence of recombination (Schlötterer, 2004). In spite of limitations derived from these same features, mtDNA segments remain an important source of information in the case of population studies, phylogeography and phylogenetic studies of closely related species, since these rapidly evolving sequences with lower effective population size are often quite informative in attempts to capture recent episodes of taxon divergence. In particular, the fast-evolving mtDNA control region (CR) may be best suited to reconstruct very recent divergence processes involving intra-specific lineages or closely related species, such as the Lycalopex group (whose overall phylogeny has so far not been studied with the CR). Therefore, in this study we employed mtDNA CR sequences to investigate the evolutionary history of Lycalopex foxes and their recent radiation in South America.
MATERIAL AND METHODS
Biological samples
We collected biological material from 117 Neotropical canids of the genus Lycalopex (Figure 1 and Table S1), including 32 L. culpaeus, 24 L. gymnocercus, 27 L. vetulus, 6 L. fulvipes, and 28 L. griseus (six of which had been initially identified as L. gymnocercus; see Figure 1 and Discussion). Five Cerdocyon thous individuals (which had been previously sequenced by Tchaicka et al., 2007) were included as outgroups.
Blood samples (preserved in a saturated salt solution of 100 mM Tris, 100 mM EDTA and 2% SDS) were collected from captive individuals, as well as wild animals captured for field ecology studies. Tissue samples were obtained from road-killed individuals and preserved in 95% ethanol.
DNA extraction and amplification
Genomic DNA was extracted from samples using a standard phenol/chloroform protocol (Sambrook et al., 1989). The 5' portion of the mtDNA control region, containing the first hypervariable segment (HVS-I), was amplified by the polymerase chain reaction (PCR; Saiki et al., 1985) using the primers MTLPRO2 and CCR-DR1 (Tchaicka et al., 2007), or H16498 (Ward et al., 1991) as an alternative reverse primer. PCR mixtures consisted of 2 μl of 10X buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM of dNTPs, 0.2 μM of each primer, 0.75 unit Taq polymerase (Invitrogen) and 1-3 μl of empirically diluted template DNA. Thermocycling conditions included 10 initial cycles of "touchdown", with 45 s denaturing at 94 °C, 45 s annealing at 60-51 °C, and 90 s extension at 72 °C. This was followed by 30 cycles of 45 s denaturing at 94 °C, 30 s annealing at 50 °C and 90 s extension at 72 °C. Products were examined on a 1% agarose gel stained with ethidium bromide, purified using shrimp alkaline phosphatase and exonuclease I, sequenced with ABI chemistry and analyzed with an ABI-PRISM 3100 automated sequencer. Sequences generated for this study are deposited in GenBank (accession numbers JX890309 - JX890389). In addition to these sequences, one previously published partial sequence of the mtDNA control region of Lycalopex sechurae (Yahnke et al., 1996) was included in the analyses, so that a total of 118 individuals (representing all known species of this genus) was analyzed.
Sequence, phylogenetic relationships and population genetics analysis
Sequences were verified and corrected using Chromas (Technelysium) or Sequencher (Gene Codes Inc.), aligned using the ClustalW algorithm implemented in MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) and visually checked. Sites or segments that could not be unambiguously aligned were excluded from all analyses. Initial sequence comparisons and assessments of variability, such as computing the number of variable sites and nucleotide diversity (π per nucleotide site, the probability that two randomly chosen homologous nucleotides are different in the sample) were performed in MEGA 6.0 using Kimura 2-parameter distances and 1000 bootstrap replicates. Estimates of gene diversity (h, the probability that two randomly chosen mtDNA lineages were different in the sample) were computed in Arlequin 3.11 (Excoffier et al., 2005) with 10,000 permutations to assess their variance.
We reconstructed the phylogenetic relationships among Lycalopex haplotypes using the Bayesian approach implemented in Beast 1.8.0 (Drummond et al., 2012). We included only complete sequences (i.e. containing no missing data), so as to maximize the stability and reliability of the inferred phylogeny. We estimated the best-fit molecular model of evolution for this data set with Modeltest 3.6 (Posada and Crandall, 1998), using the Akaike Information Criterion. The selected model (GTR+G+I) was then incorporated in the analysis. We ran the Markov Chain Monte Carlo (MCMC) process in Beast for 100 million generations, with the data sampled every 1,000 steps, and discarding the initial 10% as burn-in.
In addition to the phylogenetic analysis, we also investigated the relationships among Lycalopex haplotypes using a median-joining network approach, which was performed with Network 4.6.1.2 (Fluxus Technology). Since this method allows for ancestor-descendant relationships among haplotypes, as well as displays genealogical ambiguities more clearly than a tree-based approach, it is expected to be useful in the analysis of this recently diversified group. Moreover, since our data set included multiple individuals per species, we used this approach to assess species-level monophyly of mtDNA lineages, as well as instances of apparent ‘swaps' indicative of erroneous identification or inter-species hybridization (see Results).
To estimate divergence times within this genus, we used two methods. In the first one, we performed a Bayesian estimation using Beast, assuming an uncorrelated lognormal relaxed molecular clock. This analysis was calibrated with the mean substitution rate (μ = 3.68x10-8/year) estimated for the same CR segment in canids by Tchaicka et al. (2007), based on available data from grey wolf and coyote. In the second method, we employed a population-genetic approach based on the equation dxy=2μT (Nei, 1987), using the estimated mtDNA divergence (dxy as implemented in Mega, with K2P distances [a simpler model was incorporated here, relative to the Beast analyses, to minimize the variance around parameter estimates]) between species or groups of species, and the same substitution rate mentioned above. The divergence time between mtDNA lineages was calculated considering the 95% confidence interval (CI = ± 2SE) for all values of dxy. Using this interval for the calibration node, we obtained low, medium and fast substitution rate estimations (2.02x10-8, 3.68x10-8 and 5.34x10-8/year, respectively), which were then applied to the equivalent dxy interval estimated for each node. This approach allowed a conservative estimate of uncertainty in the dating of these rapid divergences, while providing a robust assessment of their overall temporal framework.
RESULTS
Sixty-nine different haplotypes were identified with the 588-base pair (bp) segment sequenced for Lycalopexspecies, defined by 220 variable sites and 193 parsimony-informative sites. Base composition was biased, with a deficit of guanine (T=31.1%; C=24.6%; A=26.6%; G=17.6%). No haplotypes were found to be shared among species. The estimated diversity indices are shown in Table 1. The phylogenetic analysis generated a tree topology in which several nodes were supported with high posterior probability (Figure 2). The main features of the reconstructed tree were: (i) L. vetulus as the most basal species in the genus Lycalopex; (ii) high support (PP > 0.9) for the monophyly of every species for which we had more than one individual (L. vetulusL. gymnocercusL. culpaeus and L. griseus [but see below for a special case within L. griseus]); and (iii) a well-supported, sister-group relationship between L. culpaeus and L. griseus. The single L. fulvipes sequence was placed as a sister-group to L. gymnocercus (albeit with low support), and both were included in a broader group that also contained L. culpaeus + L. griseus. This clade was in turn the sister-group of the single L. sechuraesequence (see Figure 2).
Table 1 Diversity indices (gene [h] and nucleotide [π] diversity) observed in Lycalopex species control region sequences. 
SpeciesNhΠNumber of haplotypesNumber of variable sitesNumber of parsimony informative sites
L. culpaeus320.8004 +/- 0.04070.005 ± 0.002111610
L. vetulus270.9323 +/- 0.03520.023 ± 0.004165133
L. griseus280.9398 +/- 0.03110.023 ± 0.005175027
L. gymnocercus240.9723 +/- 0.02090.022 ± 0.004174429
L. fulvipes60.6000 +/- 0.21520.009 ± 0.004354
Figure 2 Bayesian phylogeny (built with the GTR+G+I model) of 46 Lycalopex spp. haplotypes based on 588 bp of the mitochondrial DNA control region (only complete sequences were included in the analysis). Five Cerdocyon thous haplotypes were used as outgroups (see Figure S1 for results with additional outgroups). Labels are haplotype identification numbers (as coded in the Table S1: C – L. culpaeus; GR – L. griseus; G – L. gymnocercus; F – L. fulvipes; S - L. sechurae; V – L. vetulus). Values above branches indicate the Bayesian posterior probability for the adjacent node (support values are shown only for the main clades retrieved in the phylogeny). Asterisks indicate haplotypes deriving from samples initially labeled as L. gymnocercus, but whose phylogenetic position was nested within the L. griseus clade. 
The haplotype network (Figure 3) also revealed interesting patterns, which were broadly consistent with the phylogenetic tree. An interesting difference was the position of L. fulvipes, which was inferred here to be nested within the diversity of L. culpaeus haplotypes. There was evidence of population expansion (i.e. a star-like network, with few mutations between the haplotypes) within species-level clusters. On the other hand, only in the L. gymnocercus group did we observe sub-groups that showed some evidence of geographic structure (seeFigures 2 and 3).
Figure 3 Median-joining network of Lycalopex mtDNA control region haplotypes. Each circle represents a distinct haplotype (circle area is proportional to the haplotype's global frequency in the sample), color-coded per species as indicated in the internal legend. Numbers located on connecting branches represent the number of substitutions inferred to exist between haplotypes (branches with no number imply a single substitution). Haplotypes shown in black (and marked with an asterisk in the legend) were sampled in six individuals that were initially identified as L. gymnocercus (see text and Table S1 for details). 
Interestingly, both the phylogenetic analysis and the haplotype network indicated that, while the L. gymnocercussequences from southern Brazil did form a monophyletic group, mtDNA lineages from six individuals collected in Bolivia and Argentina, and identified as L. gymnocercus in the field (Figure 1Table S1), were strongly placed as members of the L. griseus clade (Figures 2 and 3).

The two methods used to estimate the divergence time between clades yielded broadly similar results. We conservatively estimated that Cerdocyon and Lycalopex diverged between 1–3 mya. L. vetulus seems to have diverged from other Lycalopex species ca. 1 mya, while the youngest event, the divergence between L. culpaeusand L. griseus, is inferred to have occurred very recently, ca. 600,000 – 350,000 years ago (ya) (Table 2).
Table 2 Divergence time estimated for Lycalopex groups with a Bayesian dating analysis and a distance-based approach (see text for details). 
Bayesian Inference
Clade (basal divergence)Age (ybp)95% HPD interval
Cerdocyon + Lycalopex1,951,0001,173,000 – 2,767,000
Lycalopex1,353,000857,000 – 1,889,000
L. sechurae + fulvipes + griseus + culpaeus +gymnocercus1,075,000652,000 – 1,546,000
L. fulvipes + griseus + culpaeus + gymnocercus806,000531,000 – 1,131,000
L. fulvipes + gymnocercus708,000475,000 – 1,076,000
L. culpaeus + griseus607,000354,000 – 900,000
L. vetulus554,000325,000 – 830,000
L. gymnocercus505,000303,000 – 750,000
L. griseus438,000246,000 – 667,000
L. culpaeus292,000139,000 – 487,000
Distance-based Inference
Pair of CladesAge (ybp)Lower and Upper bound
Cerdocyon X Lycalopex1,125,000580,000 – 2,821,000
L. vetulus X other Lycalopex1,086,000543,000 – 2,524,000
L. sechurae X (L. fulvipes + griseus + culpaeus + gymnocercus)964,000552,000 – 2,301,000
(L. fulvipes + gymnocercus) X (L. griseus + culpaeus)896,000337,000 – 2,376,000
L. fulvipes X gymnocercus706,000243,000 – 930,000
L. culpaeus X griseus366,000140,000 – 965,000
DISCUSSION
The phylogenetic analysis resolved with confidence several nodes within this group of canids, indicating that L. griseus and L. culpaeus are sister taxa (Figures 2 and 3) that diverged recently, ca. 600,000 – 350,000 ya (Table 2). These results are consistent with a previous molecular study (Yahnke et al., 1996), which reported ca.250,000 – 500,000 ya as the age of this event. In that study, based on a shorter segment of the mtDNA CR (344 bp), L. griseus and L. culpaeus were not retrieved as reciprocally monophyletic groups, possibly deriving from such a recent divergence that they had not yet achieved complete lineage sorting even for the mtDNA. Our analysis, based on longer sequences, indicates that the two species are well supported as reciprocally monophyletic mtDNA phylogroups.

The low gene diversity, the closely related haplotypes and the absence of substructure in the network analysis support the young origin of L. culpaeus in our sampled area, where Cabrera (1931) considered the occurrence of two subspecies: L. c. culpaeus and L. c. magellanicus. Our results agree with Yahnke et al. (1996) and Guzman et al.(2009) in recognizing a single genetic and morphological group for this species in central-southern Chile.

The results we obtained for L. griseus prompted a more careful comparison with the L. gymnocercus data, since some individuals phenotypically identified as L. gymnocercus (sampled in Bolivia and Argentina, see Figure 1) were strongly grouped in the L. griseus clade. There are no reliable reports of L. griseus occurring in these regions, and information on the precise distribution limits of both species is still scarce. Furthermore, although the presently assumed range of L. gymnocercus overlaps with that of L. griseus in several areas, the presence of sympatric populations has never been reported (Lucherini and Luengos Vidal, 2008). One plausible explanation for our results is that the areas where our samples were collected may be in fact inhabited by L. griseus instead ofL. gymnocercus. An alternative (non-exclusive) hypothesis is that the presence of L. griseus haplotypes in these regions may be due to hybridization and mtDNA introgression affecting these populations. Each of these hypotheses will be discussed in detail below.
Since pelage color patterns are very similar between these foxes (Zunino et al., 1995), identifying them can be challenging, which suggests that recording errors may have confused historical reports on these species' natural history and the delimitation of their ranges. Studying foxes of the same region, from Bolivia and Paraguay to central Argentina, Zunino et al. (1995) and Prevosti et al. (2013) analyzed pelage characters and cranial measurements of L. griseus and L. gymnocercus

These authors observed a clinal variation in size and color, and concluded that these foxes are conspecific (thus calling them L. gymnocercus, the senior name). In contrast, our mtDNA data do not support the merging of these two species into a single unit, since they are not sister-groups in the phylogeny, and seem to represent clearly differentiated evolutionary lineages, at least with respect to their matrilineal history. We thus consider it premature to unite them, and recommend additional taxonomic studies employing an expanded suite of approaches. In particular, it would be important to collect both morphological and molecular data from the same voucher specimens, representing the full geographic range of these species, so that results from the two types of data could be adequately compared.
The hypothesis that secondary hybridization and mtDNA introgression best explains our results should be considered in this context, as it could also account for the clinal pattern of morphological variation observed in some geographic regions (Zunino et al., 1995Prevosti et al., 2013). The samples analyzed here that were initially labeled as L. gymnocercus and that bear L. griseus mtDNA might be hybrids between male pampas foxes and female chillas, or further descendants from such a cross. Although inter-species hybridization has so far not been reported for South American foxes, this process has been clearly documented for other canid groups whose members are genetically similar due to recent divergence (e.g.Gottelli et al., 1994Roy et al., 1994VonHoldtet al., 2011Wilson et al., 2012). It is therefore plausible to postulate that secondary admixture may also occur in this recently diversified canid genus, a hypothesis that should be investigated in more detail with expanded sampling in these areas and the use of additional molecular markers.

The exact position of L. fulvipes within the internal Lycalopex clades was not completely consistent among our analyses, but the network indicates a well-defined cluster of haplotypes. This fox lives in costal temperate rainforests of Southern Chile, where it inhabits Chiloe Island and also occurs in sympatry with the chilla and culpeo in small continental areas (Medel et al., 1990Vilà et al., 2004D'Elia et al., 2013). Initially, it was described as an endemic insular canid and considered a subspecies of continental L. griseus (Redford and Eisenberg, 1992Wilson and Reeder, 1993Nowak, 1999). A molecular genetic analysis conducted by Yahnke et al. (1996) revealed that Darwin's fox is a distinct species, forming a monophyletic mtDNA lineage that was a sister taxon to the (L. griseus + L. culpaeus) cluster, from which it would have diverged in the Pleistocene, ca. 275,000 to 667,000 ya. These conclusions are corroborated by the present study, as we estimate a divergence time of ca. 700,000 to 800,000 ya between Darwin's fox and its immediately related clades.

The haplotypes of the endemic Brazilian hoary fox L. vetulus formed a well-differentiated group, supporting an early divergence of this lineage. Our phylogenetic results strongly supported a basal position for this species within the genus. The estimated time of divergence from the other species was ca. 1 – 1.3 mya. Similar values (1.95 mya and 1.3 mya) were obtained for the base of Lycalopex by Slater et al. (2009) and Perini et al. (2010), respectively, using mtDNA (coding regions) and nuclear data. 


The basal position of L. vetulus is in agreement with a phylogeny based on multiple nuclear segments (Lindblad-Toh et al., 2005), although a subsequent study (Perini et al., 2010) reporting the joint analysis of a large supermatrix of molecular and morphological characters retrieved a different resolution (with L. sechurae as the most basal species). The full resolution of this portion of the Lycalopex phylogeny will benefit from additional analyses that integrate large data sets and compare topologies derived from different types of sources.

Debate about the proper usage of Lycalopex or Pseudalopex for this group has been ongoing for many years (e.g.Cabrera, 1931Osgood, 1934Langguth, 1975Berta, 19871988Tedford et al., 1995). If the topological resolution achieved here is affirmed by future studies and consolidated for the genus, the basal phylogenetic position of the hoary fox implies that it could be kept in its own genus (Lycalopex), while the other species could move back to Pseudalopex. Alternatively, the whole cluster could be considered a single genus (Lycalopex), as inWozencraft (2005). Both schemes are compatible with the phylogeny we report here, and this decision will thus be arbitrary. We recommend that this decision be based on criteria such as clade age, morphology, and present usage, which should be established in a broader comparison across all lineages of the family Canidae.
Inferences on the history of South American foxes
Three different canid invasions from North to South America in the Pliocene or Early Pleistocene have been proposed on the basis of previous inferences of the phylogenetic relationships among extant species. One of them would include the ancestor of the fox group that includes Lycalopex, Cerdocyon, Atelocynus and Dusicyon(Langguth, 1975Wang et al., 2004). Genetic divergence values reported by Wayne et al. (1997) and Slater et al. (2009)suggest that this divergence occurred before the opening of the Panama land bridge, requiring more than one invasion event.
Contrary to this view, our mtDNA control region data indicate that the divergence between Cerdocyon andLycalopex took place ca. 1 – 3 mya, suggesting that this episode of speciation has likely occurred in South America, after immigration of a single ancestor through the Isthmus of Panama. 

A similar result has also been reported by Perini et al. (2010), who analyzed morphological and molecular (coding genes) characters. In fact, the oldest fossils assigned to Lycalopex (L. gymnocercus) are reported from Argentinean deposits of the Uquian age (2.5 to 1.5 mya), while those of Cerdocyon thous are recorded only from the Lujanian (800,000 – 10,000 ya). Interestingly, there are North American canid fossils reported from the Miocene/Early Pliocene boundary (6 – 3 mya; Berta, 1987) that have been assigned to the genus Cerdocyon, which would challenge this hypothesis. However, these specimens are very fragmentary, and Prevosti (2009), based on osteological analyses, proposed that North American fossils that were previously assigned to Cerdocyon are, in fact, related to Urocyon. The present dating results, which are congruent with our previous analyses (Tchaicka et al., 2007), support this view that the identification and phylogenetic affinities of these fossils should be reassessed.
It is generally inferred from the fossil record (Langguth, 1975Berta, 1987) and molecular data (Wayne et al., 1997;Perini et al., 2010) that, subsequently to divergence from Cerdocyon, the diversification of Lycalopex occurred in South America in the Pleistocene. Our results agree with a Pleistocene radiation of Lycalopex (Table 2), indicating that: (i) the oldest extant lineages gave rise to L. vetulus, and subsequently to L. sechurae, in the Early-Middle Pleistocene; (ii) this was followed by the rapid diversification of the griseus-culpaeus-gymnocercus-fulvipes clade, in the Middle Pleistocene; and (iii) finally, by the griseus-culpaeus recent split in the Middle-Late Pleistocene.

Extensive environmental changes took place in the Neotropical region during the Pleistocene, which may have influenced this canid radiation. Climatic changes affected the vegetation domains as well as the sea level, producing potential geographic barriers to dispersal or confining species to habitat refuges (Withmore and Prance, 1987Marroig and Cerqueira, 1997Eisenberg and Redford, 1999). Canids that had crossed the Panamanian Bridge and possibly dispersed through Andean savanna corridors had expanded their range to Patagonian and Brazilian areas by the Early Pleistocene (Langguth, 1975). At this time, the La Plata-Paraguay depression suffered a marine invasion, potentially connected to the Amazon Basin, possibly isolating a large region of Brazil (Marroig and Cerqueira, 1997). This may account for the isolation of this precursor population into two groups, one located east and the other west of this barrier. The eastern (Brazilian) population would give rise to L. vetulus, while the western one would originate the remaining lineages.

During the Pleistocene glacial phases, arid climates dominated some of the equatorial areas and savanna corridors were broken. Some mammal species that became restricted to tropical regions may have become savanna-adapted, and now occur in areas consisting of Cerrado habitat (Whitmore and Prance, 1987Eisenberg and Redford, 1999). This may be the case of the Hoary fox: its small carnassials, wide crushing molars and the exceptionally large auditory bulla (Clutton-Brock et al., 1976) suggest adaptations to a predominantly insectivorous diet. Their preference for insects now allows them to partition food resources and to coexist with other sympatric canids such as the maned wolf (Chrysocyon brachyurus) and the crab-eating fox (Cerdocyon thous) (Juarez and Marinho-Filho, 2002).

The center of the Lycalopex radiation has been proposed by Berta (1987) to have been in central Argentina, whereas Langguth (1975) suggested that central Brazil was the most likely region. These two hypotheses are reconciled here, since the main burst of speciation in this group probably did take place in Argentina or Chile (gymnocercus-fulvipes-[griseus+culpaeus]). As suggested by Yahnke et al. (1996)L. fulvipes may represent a set of relict populations of a once more widely distributed species, whose phylogenetic affinities within this group are still not completely settled. Future work should use increased sampling of individuals and characters to attempt to clarify this issue so that a more complete biogeographic inference can be devised for this group. Moreover, the prospect of fully resolving this recent South American radiation promises to shed light on some of the processes shaping the composition of mammalian communities in this region during the Pleistocene.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors wish to thank all the people and institutions listed in the Supplementary data, who provided biological samples used in this study. We are also grateful to Centro Nacional de Pesquisas para a Conservação de Predadores Naturais - CENAP / ICMBio, Instituto Pró-Carnívoros and CNPq for having supported this project, to Klaus Koepfli for help in data collection and to Lucas Gonçalves da Silva for help with the preparation of one of the figures.
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