NBR ISO 19343 de 08/2021 - Microbiologia da cadeia produtiva de alimentos - Detecção e quantificação de histamina em peixes e produtos da pesca - Método HPLC

A NBR ISO 19343 de 08/2021 - Microbiologia da cadeia produtiva de alimentos - Detecção e quantificação de histamina em peixes e produtos da pesca - Método HPLC especifica um método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para analisar a histamina em peixes e produtos da pesca (molhos de peixe, peixe maturado por enzimas em salmoura etc.) destinados ao consumo humano.

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Como deve ser feita a quantificação de histamina?

Qual é o limite de reprodutibilidade dos ensaios?

Quais as recomendações para separação por HPLC?

Quais foram os resultados do estudo interlaboratorial?

A histamina é um agente causador de envenenamento escombroide ou envenenamento por histamina de peixes. A histamina pode estar presente principalmente em Scombridae (atum, cavala) e Clupeidae (arenque, sardinha), espécies que contêm um alto nível de histidina livre. A histamina é formada pela descarboxilação da histidina pela histidina descarboxilase microbiana.

A histamina [2-(1H-imidazol-5-il) etanamina] é definida como uma molécula de nitrogênio básico de baixo peso molecular biologicamente ativa. O consumo de alimentos contendo concentração significativa de histamina pode causar sintomas semelhantes aos associados às alergias alimentares.

Este documento foi desenvolvido em resposta à necessidade de padronizar um método para a detecção e quantificação de histamina em peixes e produtos da pesca, em particular para o Regulamento Europeu 2073/2005 sobre critérios microbiológicos para alimentos. Este método permite a separação da histamina entre as aminas biogênicas em peixes e produtos da pesca. A amostra é extraída por mistura com ácido perclórico.

A derivatização da pré-coluna é realizada usando cloreto de dansil. As aminas biogênicas e os componentes da solução são separados por HPLC com coluna apropriada, usando detecção de UV. A concentração de massa de histamina é calculada a partir da razão da área do pico de histamina e do padrão interno com uma curva de calibração.

Usar apenas reagentes de grau analítico reconhecido e água em conformidade com o grau 1 da ISO 3696, a menos que especificado de outra forma. Os solventes devem ser de qualidade para análise por HPLC, a menos que especificado de outra forma.

Acetona, CH3COCH3, acetonitrila, CH3CN, tolueno, C7H8, água, grau HPLC, água, destilada ou equivalente, nitrogênio, gás, ácido perclórico, c(HClO4) = 0,2 mol/L (recomendado). Diluir 19,5 mL de HClO4 65% ou 17,2 mL de HClO4 70% em 1.000 mL de água (5.5). A solução permanece estável por seis meses se armazenada à temperatura ambiente (15 °C a 25 °C).

Para a solução de carbonato de sódio saturada, Na2CO3, dissolver 110g de carbonato de sódio em cerca de 150 mL de água (5.5). A solução está em excesso e permanece estável por três meses se armazenada a 5 °C ± 3 °C. Para a solução de cloreto de dansila, ρ(C12H12ClNO2S) = 7,5 mg/mL, dissolver 0,375 g de cloreto de dansila em 50 mL de acetona (5.1). A solução permanece estável por três semanas se armazenada no escuro a uma temperatura inferior a < −18 °C.

Para a solução de L-prolina, ρ(C5H9NO2) = 100 mg/mL, dissolver 1 g de L-prolina em 10 mL de água (5.5). A solução permanece estável por três semanas se armazenada a 5 °C ± 3 °C. Para a solução-estoque de histamina, ρ(C5H9N3) = 12,5 mg/mL, dissolver 1,034 g de dicloridrato de histamina em 50 mL de água (5.5). A solução permanece estável por um ano se armazenada a < −18 °C.

Para o padrão interno (PI) de solução-estoque de 1,7-diaminoheptano, ρ(C7H18N2) = 6,4 mg/mL, é recomendado dissolver 0,320 g de 1,7-diaminoheptano em 50 mL de água (5.5). A solução permanece estável por três semanas se armazenada a 5 °C ± 3 °C.

Utilizar um moedor, por exemplo, mixer, liquidificador, balanças (precisões de 0,1 g e 0,001 g), triturador (homogeneizador), com hastes metálicas, centrífuga, refrigerada, capaz de uma força centrífuga de 8 000g. tubos de centrífuga (plástico), com tampas de vedação, pipetas, com intervalos de 20 μL a 200 μL e 100 μL a 1 000 μL, tubos (vidro resistente à temperatura), com tampas de vedação, agitador tipo vórtex, banho-maria, a 60 °C ± 1 °C, com tampa escura ou equivalente, refrigerador, com capacidade para temperaturas de 5 °C ± 3 °C, freezer, com capacidade para temperaturas < −18 °C. evaporador de nitrogênio, agulhas descartáveis de 20G 0,9 mm, filtros descartáveis de 0,2 μm [politetrafluoroetileno (PTFE)/polipropileno (PP)], seringas, descartáveis de 2 mL, sistema LC, com bomba, amostrador automático refrigerado, forno para coluna (25 °C ± 2 °C), detector de UV λ = 254 nm (UV).

Para a preparação da amostra, homogeneizar a amostra (carne de peixe) moendo na batedeira. Transferir uma alíquota de ensaio de 5 g ± 0,1 g de homogenato de peixe para um tubo de centrifugação (6.5). Adicionar 10 mL de ácido perclórico (5.7) e 100 μL de 1,7-diaminoheptano (5.12) a 5 g de peixe no tubo de centrifugação e misturar. Após homogeneização completa, centrifugar a 8.000 g por 5 min a 4 °C.

Transferir 100 μL do sobrenadante para um tubo, adicionar 300 μL de solução de carbonato de sódio e 400 μL de solução de cloreto de dansil (5.9). Agitar em agitador tipo vórtex (6.8) e incubar por 5 min no escuro a 60 °C. Resfriar o tubo em água fria da torneira e adicionar 100 μL de solução de L-prolina. Agitar em agitador tipo vórtex (6.8) e colocar o tubo no escuro por 15 min. O sobrenadante pode ser armazenado a < −18 ° C por uma semana.

Para a purificação, adicionar 500 μL de tolueno e agitar em agitador tipo vórtex. A manipulação pode ser interrompida nesta etapa, com armazenamento a < −18 °C por no máximo uma semana. Transferir o máximo possível da fase orgânica superior para um novo tubo e secar na capela de exaustão com um fluxo de nitrogênio. A fase orgânica tolueno contém a histamina derivatizada e não a fase “não orgânica” (aquosa).

A fase orgânica pode ser facilmente recuperada pelo congelamento da fase aquosa (< −18 °C por 30 min no mínimo). Além disso, o congelamento pode melhorar a qualidade da fase orgânica superior. Ressuspender o tubo seco com 200 μL de acetonitrila/água (fração de volume 60/40) e agitar em agitador tipo vórtex. Filtrar a solução em um frasco de vidro do amostrador automático e preencher o amostrador automático.

Os sistemas HPLC e UHPLC podem ser usados. Os parâmetros indicativos dependendo do instrumento e da coluna são dados no Anexo A. A sigla LC (liquid chromatography) pode ser utilizada também em português como CL (cromatografia líquida). E a sigla UHPLC (ultra high performance liquid chromatography) também pode ser utilizada como CLUE (cromatografia líquida de ultra eficiência).

Convém que as amostras-padrão sejam preparadas por suplementação de volumes de solução-estoque de histamina para homogeneizar as amostras preparadas de acordo com essa norma a partir de uma matriz livre de histamina. Adicionar os volumes conforme especificado na tabela abaixo para a amostra livre de histamina e prosseguir para a etapa de extração e, então, derivatização, purificação e LC. Para evitar o efeito matriz e as tendências (bias), preparar uma curva de calibração na mesma matriz (sem histamina) que a amostra analisada.

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Os resultados do estudo interlaboratorial para determinar a precisão do método estão resumidos no Anexo B. Os valores derivados do estudo interlaboratorial podem não ser aplicáveis a intervalos de concentração e tipos de alimentos diferentes dos indicados no Anexo B.

A diferença absoluta entre dois resultados de ensaios individuais independentes ou a razão do maior para o menor de dois resultados de ensaios na escala normal, obtida usando o mesmo método em material de ensaio idêntico, no mesmo laboratório, pelo mesmo operador, usando o mesmo equipamento, dentro do menor intervalo de tempo possível, irá em não mais de 5% dos casos exceder o limite de repetibilidade r. A diferença absoluta entre dois resultados de ensaios individuais obtidos usando o mesmo método em material de ensaio idêntico, em laboratórios diferentes, com operadores diferentes, usando equipamentos diferentes, irá em não mais de 5% dos casos exceder o limite de reprodutibilidade R.

FONTE: Equipe Target

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