Mecanismo que afeta multiplicação de linhagem do vírus da dengue é descoberto

18 de julho de 2018

Janaína Simões  |  Agência FAPESP  – Uma linhagem do vírus da dengue 1 encontrada no Brasil consegue prevalecer sobre outra, apesar de se multiplicar menos nos mosquitos portadores do vírus e nas células humanas infectadas. A descoberta foi feita em uma pesquisa colaborativa apoiada pela FAPESP e desenvolvida por diversas instituições nacionais e uma universidade dos Estados Unidos. 

Segundo a pesquisa, a linhagem ativa menos a resposta do sistema imunológico dos doentes. Sendo menos combatido, o vírus consegue se multiplicar mais no corpo humano, aumentando as chances de a pessoa ser picada por um mosquito e contagiar outras. Assim, essa linhagem consegue superar outra, com capacidade muito maior de se multiplicar em mosquitos e em pacientes. 

Os pesquisadores estudaram as linhagens 1 e 6 (L1 e L6) do vírus da dengue de tipo 1 que afetam a população de São José do Rio Preto, no interior de São Paulo. O estudo mostrou que, apesar de a L1 ter maior capacidade de multiplicação no mosquito e nas células, a L6 consegue minimizar e até desativar as respostas imunológicas do corpo humano, fazendo com que essa linhagem ocupe o local da L1.

“Havia três práticas para investigar as situações de multiplicação do vírus da dengue e explicar por que uma linhagem superava outra. Nossa pesquisa trouxe à tona um novo fenômeno que explica como um vírus sobrevive em uma população”, disse Maurício Lacerda Nogueira, professor adjunto do Laboratório de Pesquisas em Virologia do Departamento de Doenças Dermatológicas, Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de Medicina de São José do Preto (Famerp) e um dos autores de artigo publicado recentemente na PLOS Neglected Tropical Diseases com resultados da pesquisa. 

“Mas não se trata só de observar se o vírus se multiplica mais ou menos no mosquito ou na célula humana para entender por que uma linhagem toma o lugar de outra. Precisamos saber como o vírus interage com o ser humano como um todo”, disse Nogueira, que também é presidente da Sociedade Brasileira de Virologia, à Agência FAPESP. 

O estudo traz novos conhecimentos fundamentais para a produção de vacinas no combate à doença. “Compreender, de forma global, como o vírus interage com a população nos ajuda a entender como as vacinas funcionam e é fundamental para podermos desenhá-las”, disse. 

Sabe-se que no Brasil houve três introduções de vírus da dengue do tipo 1: as linhagens 1, 3 e 6, todas com o mesmo genótipo. Em São José do Rio Preto, observou-se inicialmente a circulação da L6 pelo menos desde 2008. Em 2010, a L1 foi identificada pela primeira vez na cidade. Por um período, ambas circularam conjuntamente. 

Esperava-se que L1 apresentasse maior capacidade de multiplicação nas células e nos mosquitos transmissores, o Aedes aegypti, já que ela chegou depois de L6 e conseguiu se instalar. Porém, a partir de 2013, a L1 começou a diminuir até não ser mais detectada na população, contrariando a expectativa de que a nova linhagem fosse substituir a L6. 

Esse fato contrariava o conhecimento científico produzido a respeito da prevalência de uma linhagem sobre outra, um fenômeno chamado substituição de clado (grupo de organismos originados de um único ancestral comum). 

Ele pode ocorrer se a linhagem introduzida no meio se multiplica melhor nas células humanas do que a que já estava no ambiente. A outra hipótese é a de que a linhagem que chegou posteriormente se multiplica mais no mosquito. Em ambos os casos, diz-se que o vírus que suplantou o outro tem um “fitness viral” melhor.

Fitness epidemiológico

Uma terceira explicação surgiu a partir de um estudo feito em Porto Rico em 2015, onde se encontrou uma linhagem do vírus da dengue com um fitness viral pior do que as que já estavam no ambiente, mas que acabou prevalecendo sobre as demais. Descobriu-se que essa linhagem inibe o sistema interferon, proteína que induz uma resposta antiviral toda vez que alguém é infectado por vírus, diminuindo sua replicação. Nesse caso, o processo se chama fitness epidemiológico. 

No caso brasileiro, nada disso ocorreu. Primeiro, os pesquisadores sequenciaram os genomas das duas linhagens de vírus. Elas têm 47 aminoácidos diferentes, são bem distantes geneticamente, mas competiram entre si e a L6 venceu. 

“As informações que tínhamos até ali dizia que o esperado era que a L6 se multiplicasse melhor, daí ter prevalecido, mas, quando olhamos células contaminadas de humanos e de macacos, vimos que a L1 multiplica 10 vezes mais, em média, do que a L6”, disse Nogueira. 

Se L1 não o fazia nas células humanas, a hipótese era de que o melhor fitness viral se explicaria porque a L6 se multiplicaria melhor no mosquito. Então os cientistas infectaram oralmente mosquitos cativos – criados para experimentos científicos. Para se alimentar, os mosquitos picavam uma membrana que tinha sangue de camundongo contaminado com vírus da dengue das linhagens 1 e 6. “De novo, a L1 se multiplicou 10 vezes melhor no mosquito do que a L6”, disse. 

Surgiu a possibilidade de que os mosquitos cativos talvez não fossem representativos em relação aos encontrados no meio ambiente. Feito um novo experimento, em que ovos do mosquito foram coletados no ambiente e eclodidos em laboratório, chegou-se ao mesmo resultado: L1 continuava a ser mais eficiente na multiplicação do que L6, apesar de os estudos mostrarem que pacientes contaminados com L6 tinham uma carga viral muito maior do que os infectados pela L1. 

Sobrou, então, a hipótese do fitness epidemiológico, como ocorreu em Porto Rico, onde foi encontrado um vírus da dengue que codificava um RNA que inibia o interferon. Não se confirmou a interferência no caso brasileiro. “Aí percebemos que estávamos diante de outro mecanismo, diverso dos três já conhecidos”, disse Nogueira. 

Para resolver o mistério, os pesquisadores passaram a fazer o estudo dos aspectos imunológicos da interação do vírus com a resposta imune do organismo. Usando sistemas computacionais de predição, verificaram que L1 conseguia ativar muito mais os linfócitos B e T, que compõem o sistema imune, do que L6. 

A seguir, nos estudos envolvendo camundongos e células doadas por pessoas contaminadas com o vírus, os cientistas conseguiram estimular e medir a ativação de respostas dos linfócitos B e T, notando que L6 ativava uma resposta mais fraca do que L1. Mediram ainda o nível de citocinas presentes no soro recolhido dos pacientes. As citocinas têm como papel ativar, mediar ou regular a resposta imune. 

“De forma geral, observamos que a L1 multiplica muito melhor, mas também ativa fortemente o sistema imune, tanto do humano quanto do camundongo, ou seja, a L1 induz uma resposta muito grande do organismo contra o vírus. Já a L6 se multiplica menos, mas ou ela inibe ou não estimula ou estimula pouco as respostas do sistema imune. Por isso, o organismo demora mais para reconhecer o vírus”, disse.

Graças a isso, a quantidade de vírus da linhagem 6 no ser humano é, em média, 10 vezes maior do que a da 1, constataram os pesquisadores. Eles também observaram que o vírus da linhagem 1 se multiplica muito mais no mosquito e tem replicação local muito maior ao infectar a pessoa. 

Só que essa replicação induz uma ativação forte de linfócitos B e T, levando ao aumento de citocinas, ou seja, gera uma forte resposta imune, capaz de inibir a replicação sistêmica do vírus no corpo. Com isso, a carga viral é menor, diminuindo a disseminação para mosquitos, ou seja, menos gente será infectada por ele.

No caso do vírus da linhagem 6, apesar de sua menor capacidade de multiplicação no mosquito e também no local de replicação inicial após picar uma pessoa, ele produz uma ativação fraca de células B e T e estimula a produção de citocinas que, na verdade, inibem a resposta imune, em vez de estimulá-la. 

“Com isso, há uma replicação sistêmica na pessoa muito maior, ou seja, uma quantidade de vírus maior na população, o que é capaz de infectar mais mosquitos. Concluímos então que L6 tem um melhor fitness epidemiológico do que o L1, que, por sua vez, tem melhor fitness viral do que L6”, disse Nogueira. 

A pesquisa durou dois anos e meio e envolveu um grupo de 24 pesquisadores da Famerp, da Fundação Oswaldo Cruz, das universidades federais do Rio de Janeiro (UFRJ) e Minas Gerais (UFMG), da Unesp e um colaborador estrangeiro – Nikos Vasilakis, pesquisador do Centro de Doenças Tropicais da Universidade do Texas (Galveston), dos Estados Unidos, e também coautor do artigo. 

“Empregando análises epidemiológicas, filogenéticas, moleculares e imunológicas, os autores da pesquisa demonstraram que diferenças na resposta imune no hospedeiro determinam a dinâmica da circulação da dengue de duas linhagens circulantes na cidade, sugerindo que os fatores que influenciam a dinâmica da transmissão da dengue são muito mais complexos do que anteriormente se suspeitava”, disse Vasilakis.

O artigo Viral immunogenicity determines epidemiological fitness in a cohort of DENV-1 infection in Brazil (doi: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006525), de Tauyne Menegaldo Pinheiro, Maurício Lacerda Nogueira e outros, está disponível em: http://journals.plos.org/plosntds/article?id=10.1371%2Fjournal.pntd.0006525.

Processo evolutivo do mosquito da dengue é rápido, constata estudo

05 de novembro de 2015

Karina Toledo | Agência FAPESP – No que se refere à capacidade de adaptação ao ambiente hostil das grandes cidades, talvez nenhuma espécie de mosquito tenha conseguido tanto sucesso quanto o Aedes aegypti – aquele com o corpo coberto de listras brancas que, para azar dos humanos, é capaz de transmitir doenças como dengue, febre amarela, febre chikungunya e zika.

Além de resistência a alguns inseticidas, a espécie vem adquirindo a habilidade de se reproduzir em volumes cada vez menores de água – que nem precisa estar tão limpa quanto no passado. Os insetos, que antes só picavam durante o dia, passaram a atacar também à noite, bastando apenas alguma luz artificial a revelar o caminho até a vítima.

Um estudo recentemente publicado na revista PLoS One por um grupo de pesquisadores do Instituto Butantan pode ajudar a entender de onde vem esse potencial adaptativo tão superior ao de outras espécies de mosquito.
Os pesquisadores acompanharam durante 14 meses (cinco estações climáticas) uma população do inseto presente na Subprefeitura do Butantã, em São Paulo. Mensalmente, foram coletados ovos, larvas e pupas, que foram divididos em cinco grupos – cada um representando uma estação climática. Ao todo, foram estudadas aproximadamente 20 gerações de mosquitos de uma mesma população.

Por dois métodos diferentes, os pesquisadores investigaram e compararam os grupos a variabilidade genética existente entre os indivíduos, ou seja, como era a variação de alelos de DNA ao longo do tempo.
“Desde a primeira amostragem até a última, em todas as comparações feitas mês a mês, encontramos diferenças estatísticas significativas. Como se estivéssemos comparando indivíduos de populações diferentes, ou seja, coletados em locais distintos. Essa alta variabilidade genética indica que é uma espécie com muita capacidade de evoluir rapidamente e pode significar que se adapta rapidamente às adversidades”, afirmou Lincoln Suesdek, coordenador do estudo apoiado pela FAPESP.
O trabalho foi feito durante a Iniciação Científica de Caroline Louise, sob orientação de Suesdek. Segue uma linha de pesquisa que teve início durante o doutorado de Paloma Oliveira Vidal, também bolsista da FAPESP.

“Durante o doutorado, coletei amostras de mosquito de várias cidades do Estado de São Paulo em uma única época do ano. Comparei então a variabilidade genética entre as diferentes populações em uma única geração. Os resultados foram parecidos com os obtidos no projeto que comparou uma mesma população ao longo de várias gerações”, contou Vidal.

De acordo com Suesdek, nos dois projetos foram usados dois diferentes métodos para aferir a variabilidade genética. Um deles é tradicionalmente usado em estudos de parentesco: os marcadores microssatélites. Eles avaliam unidades de repetição de pares de bases do DNA e acusam as variações evolutivas mais recentes. O método tem ligeira semelhança ao usado em testes de paternidade.

O outro método, ainda inédito nesse tipo de estudo, foi a avaliação da morfologia da asa. Nesse caso os pesquisadores elegeram alguns pontos da asa do mosquito como marcos anatômicos. Uma série de softwares avalia a variação posicional entre esses pontos nos diferentes grupos.

“Os marcadores microssatélites são bem informativos, mas esse método é caro e trabalhoso. Queríamos testar um marcador mais simples e barato. Estudos anteriores indicavam que a forma da asa dos mosquitos, assim como a fisionomia dos seres humanos, está ligada à herança familiar. Mas é difícil perceber a olho nu”, contou Suesdek.
O objetivo do grupo era avaliar se os dois marcadores usados seguiriam o mesmo padrão. Os resultados indicaram que de fato há uma correlação, mas que ela não é de 100%.

“Conseguimos prever uma parte da variabilidade genética estudando a asa, mas o método não substitui a análise do DNA. Pode ser uma metodologia preliminar, a ser usada quando não se conhece nada sobre uma população e se deseja fazer um teste rápido para entender a microevolução”, disse Suesdek.

Controle ao longo do ano

Ao comparar o resultado das análises feitas durante seu projeto com dados da literatura científica, Louise concluiu que a dinâmica evolutiva do Aedes em São Paulo é mais acelerada do que em outras cidades onde há registros semelhantes.

“Acreditava-se que no inverno a variabilidade seria menor, pois com o frio a reprodução do inseto se torna mais lenta. De fato a taxa reprodutiva é menor nos meses de inverno, mas a variabilidade genética se manteve alta em todos os meses avaliados. Esse resultado reforça a necessidade de combater o mosquito o ano inteiro, não apenas no verão”, disse Louise.

Na avaliação de Louise, a melhor forma de controlar o mosquito é a adoção de medidas combinadas, como a eliminação de criadouros e a rotação de inseticidas, para que não ocorra a seleção de indivíduos resistentes.

Suesdek também ressaltou a necessidade de se investir em pesquisas voltadas ao desenvolvimento de novos métodos de controle químico e biológico, como novos inseticidas e mosquitos transgênicos.
“O cenário é preocupante e todas as pessoas têm uma parcela de responsabilidade. Tanto o governo quanto a população precisam fazer sua parte”, afirmou a equipe.

O que é Febre Zika?

Sinônimos: zika vírus

Febre Zika é uma infecção causada pelo vírus ZIKV, transmitida pelo mosquito Aedes aegypti, mesmo transmissor da dengue da febre chikungunya. O vírus Zika teve sua primeira aparição registrada em 1947, quando foi encontrado em macacos da Floresta Zika, em Uganda. Entretanto, somente em 1954 os primeiros seres humanos foram contaminados, na Nigéria. O vírus Zika atingiu a Oceania em 2007 e a França no ano de 2013. O Brasil notificou os primeiros casos de vírus Zika em 2015, no Rio Grande do Norte e na Bahia.
Apesar de a doença ter chegado ao Brasil, ela não é uma preocupação tão grande quanto a dengue, uma vez que seus sintomas são brandos e duram pouco tempo. Os maiores incômodos são febre é baixa, coceira e comichão na pele, além de manchas avermelhadas. É necessário, contudo, ficar atento com as contaminações combinadas – dengue, febre chikungunya e Zika vírus – uma vez que os efeitos dessas infecções em conjunto ainda não são conhecidos.

Causas

O vírus ZIKV não é transmitido de pessoa para pessoa. O contágio se dá pelo mosquito que, após picar alguém contaminado, pode transportar o ZIKV durante toda a sua vida, transmitindo a doença para uma população que não possui anticorpos contra ele.
O ciclo de transmissão ocorre do seguinte modo: a fêmea do mosquito deposita seus ovos em recipientes com água. Ao saírem dos ovos, as larvas vivem na água por cerca de uma semana. Após este período, transformam-se em mosquitos adultos, prontos para picar as pessoas. O Aedes aegypti procria em velocidade prodigiosa e o mosquito adulto vive em média 45 dias. Uma vez que o indivíduo é picado, demora no geral de 3 a 12 dias para o vírus Zika causar sintomas.

A transmissão do ZIKV raramente ocorre em temperaturas abaixo de 16° C, sendo que a mais propícia gira em torno de 30° a 32° C - por isso ele se desenvolve em áreas tropicais e subtropicais. A fêmea coloca os ovos em condições adequadas (lugar quente e úmido) e em 48 horas o embrião se desenvolve. É importante lembrar que os ovos que carregam o embrião do mosquito transmissor da febre Zika podem suportar até um ano a seca e serem transportados por longas distâncias, grudados nas bordas dos recipientes e esperando um ambiente úmido para se desenvolverem. Essa é uma das razões para a difícil erradicação do mosquito. Para passar da fase do ovo até a fase adulta, o inseto demora dez dias, em média. Os mosquitos acasalam no primeiro ou no segundo dia após se tornarem adultos. Depois, as fêmeas passam a se alimentar de sangue, que possui as proteínas necessárias para o desenvolvimento dos ovos.

O mosquito Aedes aegypti mede menos de um centímetro, tem aparência inofensiva, cor café ou preta e listras brancas no corpo e nas pernas. Costuma picar nas primeiras horas da manhã e nas últimas da tarde, evitando o sol forte. No entanto, mesmo nas horas quentes ele pode atacar à sombra, dentro ou fora de casa. Há suspeitas de que alguns ataquem durante a noite. O indivíduo não percebe a picada, pois não dói e nem coça no momento. Por ser um mosquito que voa baixo - até dois metros - é comum ele picar nos joelhos, panturrilhas e pés.

Sintomas de Febre Zika

Os sintomas de infecção pelo vírus Zika começam de 3 a 12 dias após a picada do mosquito e são:

• Febre baixa (entre 37,8 e 38,5 graus)
• Dor nas articulações (artralgia), mais frequentemente nas articulações das mãos e pés, com possível inchaço
• Dor muscular (mialgia)
• Dor de cabeça e atrás dos olhos
• Erupções cutâneas (exantemas), acompanhadas de coceira. Podem afetar o rosto, o tronco e alcançar membros periféricos, como mãos e pés.

Sintomas mais raros de infecção pelo vírus Zika incluem:

• Dor abdominal
• Diarreia
• Constipação
• Fotofobia e conjuntivite
• Pequenas úlceras na mucosa oral.
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Diagnóstico de Febre Zika

Se você suspeita de febre chikungunya, vá direto ao hospital ou clínica de saúde mais próxima. O diagnóstico deverá ser feito por meio de análise clínica e exame sorológico (de sangue).
A partir de uma amostra de sangue, os especialistas buscam a presença de anticorpos específicos para combater o vírus Zíka no sangue. Isso indicará que a doença está circulando pelo seu corpo e que o organismo está tentando combatê-lo. A técnica RT-PCR, de biologia molecular, também pode ser usada para identificar o vírus em estágios precoces de contaminação.
Para diferenciar o vírus Zika da febre chikungunya e da dengue, outros exames podem ser feitos:

• Testes de coagulação
• Eletrólitos
• Hematócrito
• Enzimas do fígado
• Contagem de plaquetas
• Raio X do tórax para demonstrar efusões pleurais.

Tratamento de Febre Zika

O tratamento para o vírus Zika é sintomático. Isso que dizer que não há tratamento específico para a doença, só para alívio dos sintomas. Para limitar a transmissão do vírus, os pacientes devem ser mantidos sob mosquiteiros durante o estado febril, evitando que algum Aedes aegypti o pique, ficando também infectado.

Pacientes afetados com a febre Zika podem usar medicamentos anti-inflamatórios e analgésicos. Entretanto, assim como na dengue e febre chikungunya, os medicamentos à base de ácido acetilsalicílico (aspirina) ou que contenham a substância associada devem ser evitados. Eles têm efeito anticoagulante e podem causar sangramentos. Outros anti-inflamatórios não hormonais (diclofenaco, ibuprofeno e piroxicam) também devem ser evitados. O uso destas medicações pode aumentar o risco de sangramentos.
Os sintomas se recuperam espontaneamente após 4-7 dias. Se você sentir incômodo por mais tempo, volte ao médico para investigar outras doenças.

Prevenção

O mosquito Aedes aegypti é o transmissor do vírus e suas larvas nascem e se criam em água parada. Por isso, evitar esses focos da reprodução desse vetor é a melhor forma de se prevenir contra o vírus Zika. Veja como:

Evite o acúmulo de água

O mosquito coloca seus ovos em água limpa, mas não necessariamente potável. Por isso é importante jogar fora pneus velhos, virar garrafas com a boca para baixo e, caso o quintal seja propenso à formação de poças, realizar a drenagem do terreno. Também é necessário lavar a vasilha de água do bicho de estimação regularmente e manter fechadas tampas de caixas d'água e cisternas.

Coloque areia nos vasos de plantas

O uso de pratos nos vasos de plantas pode gerar acúmulo de água. Há três alternativas: eliminar esse prato, lavá-lo regularmente ou colocar areia. A areia conserva a umidade e ao mesmo tempo evita que e o prato se torne um criadouro de mosquitos. Ralos pequenos de cozinhas e banheiros raramente tornam-se foco de febre Zika devido ao constante uso de produtos químicos, como xampu, sabão e água sanitária. Entretanto, alguns ralos são rasos e conservam água estagnada em seu interior. Nesse caso, o ideal é que ele seja fechado com uma tela ou que seja higienizado com desinfetante regularmente.

Limpe as calhas

Grandes reservatórios, como caixas d'água, são os criadouros mais produtivos de febre Zika, mas as larvas do mosquito podem ser encontradas em pequenas quantidades de água também. Para evitar até essas pequenas poças, calhas e canos devem ser checados todos os meses, pois um leve entupimento pode criar reservatórios ideais para o desenvolvimento do Aedes aegypti.

Coloque tela nas janelas

Embora não seja tão eficaz, uma vez que as pessoas não ficam o dia inteiro em casa, colocar telas em portas e janelas pode ajudar a proteger sua família contra o mosquito Aedes aegypti. O problema é quando o criadouro está localizado dentro da residência. Nesse caso, a estratégia não será bem sucedida. Por isso, não se esqueça de que a eliminação dos focos da doença é a maneira mais eficaz de proteção.

Lagos caseiros e aquários

Assim como as piscinas, a possibilidade de laguinhos caseiros e aquários se tornarem foco do vírus Zika deixou muitas pessoas preocupadas. Porém, peixes são grandes predadores de formas aquáticas de mosquitos. O cuidado maior deve ser dado, portanto, às piscinas que não são limpas com frequência.

Seja consciente com seu lixo

Não despeje lixo em valas, valetas, margens de córregos e riachos. Assim você garante que eles ficarão desobstruídos, evitando acúmulo e até mesmo enchentes. Em casa, deixe as latas de lixo sempre bem tampadas.

Uso de repelentes

O uso de repelentes, principalmente em viagens ou em locais com muitos mosquitos, é um método paliativo para se proteger contra o vírus Zika. Recomenda-se, porém, o uso de produtos industrializados. Repelentes caseiros, como andiroba, cravo-da-índia, citronela e óleo de soja não possuem grau de repelência forte o suficiente para manter o mosquito longe por muito tempo. Além disso, a duração e a eficácia do produto são temporárias, sendo necessária diversas reaplicações ao longo do dia, o que muitas pessoas não costumam fazer.

Suplementação vitamínica do complexo B

Tomar suplementos de vitaminas do complexo B pode mudar o odor que nosso organismo exala, confundindo o mosquito e funcionando como uma espécie de repelente. Outros alimentos de cheiro forte, como o alho, também podem ter esse efeito. No entanto, a suplementação deveria começar a ser feita antes da alta temporada de infecção do mosquito, e nem isso garante 100% de proteção contra o vírus Zika. A estratégia deve se somar ao combate de focos da larva do mosquito, ao uso do repelente e à colocação de telas em portas e janelas, por exemplo.

O que é Febre Chikungunya?

Sinônimos: febre chicungunha

Febre Chikungunya é uma doença parecida com a dengue, causada pelo vírus CHIKV, da família Togaviridae. Seu modo de transmissão é pela picada do mosquito Aedes aegypti infectado e, menos comumente, pelo mosquito Aedes albopictus.

Seus sintomas são semelhantes aos da dengue: febre, mal-estar, dores pelo corpo, dor de cabeça, apatia e cansaço. Porém, a grande diferença da febre chikungunya está no seu acometimento das articulações: o vírus avança nas juntas dos pacientes e causa inflamações com fortes dores acompanhadas de inchaço, vermelhidão e calor local.

A febre chikungunya teve seu vírus isolado pela primeira vez em 1950, na Tanzânia. Ela recebeu esse nome pois chikungunya significa “aqueles que se dobram” no dialeto Makonde da Tanzânia, termo este usado para designar aqueles que sofriam com o mal. A doença, apesar de pouco letal, é muito limitante. O paciente tem dificuldade de movimentos e locomoção por causa das articulações inflamadas e doloridas, daí o “andar curvado”.

Os mosquitos transmitiam a doença para africanos abaixo do Saara, mas os surtos não ocorriam até junho de 2004. A partir desse ano, a febre chikungunya teve fortes manifestações no Quênia, e dali se espalhou pelas ilhas do Oceano Índico. Da primavera de 2004 ao verão de 2006, ocorreu um número estimado em 500 mil casos.

A epidemia propagou-se do Oceano Índico à Índia, onde grandes eventos emergiram em 2006. Uma vez introduzido, o CHIKV alastrou-se em 17 dos 28 estados da Índia e infectou mais de 1,39 milhão de pessoas antes do final do ano. O surto da Índia continuou em 2010 com novos casos aparecendo em áreas não envolvidas no início da fase epidêmica.
Os casos também têm sido propagados da Índia para as Ilhas de Andaman e Nicobar, Sri Lanka, Ilhas Maldivas, Singapura, Malásia, Indonésia e numerosos outros países por meio de viajantes infectados. A preocupação com a propagação do CHIKV atingiu um pico em 2007, quando o vírus foi encontrado no norte da Itália após ser introduzido por um viajante com o vírus advindo da Índia.
As taxas de ataque em comunidades afetadas em recentes epidemias variam de 38% a 63% e, embora em níveis reduzidos, muitos casos destes países continuam sendo relatados. Em 2010, o vírus continua a causar doença em países como Índia, Indonésia, Myanmar, Tailândia, Maldivas e reapareceu na Ilha Réunion.
Casos importados também foram identificados no ano de 2010 em Taiwan, França, Estados Unidos e Brasil, trazidos por viajantes advindos, respectivamente, da Indonésia, da Ilha Réunion, da Índia e do sudoeste asiático.
Atualmente, o vírus CHIKV foi identificado em ilhas do Caribe e Guiana Francesa, país latino-americano que faz fronteira com o estado do Amapá. Isso quer dizer que a febre chikungunya está migrando e pode chegar ao Brasil, onde os mosquitos Aedes aegypti e o Aedes albopictus têm todas as condições de espalhar esse novo vírus.

Febre chikungunya é transmitida pelo mosquito Aedes aedypti

Causas

A febre chikugunya não é transmitida de pessoa para pessoa. O contágio se dá pelo mosquito que, após um período de sete dias contados depois de picar alguém contaminado, pode transportar o vírus CHIKV durante toda a sua vida, transmitindo a doença para uma população que não possui anticorpos contra ele. Por isso, o objetivo é estar atento para bloquear a transmissão tão logo apareçam os primeiros casos.
O ciclo de transmissão ocorre do seguinte modo: a fêmea do mosquito deposita seus ovos em recipientes com água. Ao saírem dos ovos, as larvas vivem na água por cerca de uma semana. Após este período, transformam-se em mosquitos adultos, prontos para picar as pessoas. O Aedes aegypti procria em velocidade prodigiosa e o mosquito adulto vive em média 45 dias. Uma vez que o indivíduo é picado, demora no geral de dois a 12 dias para a febre chikungunya se manifestar, sendo mais comum cinco a seis dias.
A transmissão da febre chikungunya raramente ocorre em temperaturas abaixo de 16° C, sendo que a mais propícia gira em torno de 30° a 32° C - por isso ele se desenvolve em áreas tropicais e subtropicais. A fêmea coloca os ovos em condições adequadas (lugar quente e úmido) e em 48 horas o embrião se desenvolve. É importante lembrar que os ovos que carregam o embrião do mosquito transmissor da febre chikungunya podem suportar até um ano a seca e serem transportados por longas distâncias, grudados nas bordas dos recipientes e esperando um ambiente úmido para se desenvolverem. Essa é uma das razões para a difícil erradicação do mosquito. Para passar da fase do ovo até a fase adulta, o inseto demora dez dias, em média. Os mosquitos acasalam no primeiro ou no segundo dia após se tornarem adultos. Depois, as fêmeas passam a se alimentar de sangue, que possui as proteínas necessárias para o desenvolvimento dos ovos.
O mosquito Aedes aegypti mede menos de um centímetro, tem aparência inofensiva, cor café ou preta e listras brancas no corpo e nas pernas. Costuma picar, transmitindo a febre chikungunya, nas primeiras horas da manhã e nas últimas da tarde, evitando o sol forte. No entanto, mesmo nas horas quentes ele pode atacar à sombra, dentro ou fora de casa. Há suspeitas de que alguns ataquem durante a noite. O indivíduo não percebe a picada, pois não dói e nem coça no momento. Por ser um mosquito que voa baixo - até dois metros - é comum ele picar nos joelhos, panturrilhas e pés.
Além de transmitir dengue e febre chikungunya, a fêmea do Aedes aegypti também passou a carregar o vírus responsável pela febre Zika.

Fatores de risco

A febre chikungunya pode afetar pessoas de todas as idades e ambos os sexos. Entretanto, a apresentação clínica é conhecida por variar de acordo com a idade, sendo os muito jovens (neonatal) e idosos os mais afetados pelas manifestações graves da doença. Além da idade, as comorbidades (doenças subjacentes) também vêm sendo identificadas como fator de risco para pior evolução da doença.

Saiba mais

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A maioria das infecções por CHIKV que ocorre durante a gravidez não resulta na transmissão do vírus para o feto. Existem, porém, raros relatos de abortos espontâneos após a infecção maternal por febre chikungunya. Aqueles infectados durante o período intraparto podem também desenvolver doenças neurológicas, sintomas hemorrágicos e doença do miocárdio. Anormalidades laboratoriais incluíram testes de função hepática aumentados, plaquetas e contagem de linfócitos reduzidos e níveis de protrombina diminuídos.
Indivíduos maiores de 65 anos tiveram uma taxa de mortalidade 50 vezes superior quando comparados ao adulto jovem (menores de 45 anos de idade). Apesar de não ser claro por que os adultos mais velhos têm um risco aumentado para doença mais grave, pode ser devido à frequência de comorbidades ou resposta imunológica diminuída.

Sintomas

Sintomas de Febre Chikungunya

O período de incubação da febre chikungunya varia de dois a 12 dias. Muitas pessoas infectadas com CHIKV não apresentarão sintomas. O quadro clínico é muito semelhante ao da dengue, e os sintomas de febre chikungunya são:

• Febre
• Dor nas articulações
• Dor nas costas
• Dor de cabeça.

Outros sintomas incluem:

• Erupções cutâneas
• Fadiga
• Náuseas
• Vômitos
• Mialgias.

Os sintomas comuns de chikungunya são graves e muitas vezes debilitantes, sendo as mãos e pés mais afetados. No entanto, pernas e costas inferiores frequentemente podem estar envolvidas.

Febre chikungunya x Dengue

A febre chikungunya deve ser diferenciada da dengue, a qual tem um potencial para resultados muito piores, incluindo a morte. Entretanto, as duas doenças podem ocorrer juntas no mesmo paciente. Observações de surtos prévios na Tailândia e na Índia têm demonstrado as principais características que distinguem o CHIKV de dengue. Na febre chikungunya, o choque ou hemorragia grave são raramente observados. O início é mais agudo e a duração da febre é muito mais curta.
Embora as pessoas possam se queixar de dor corporal difusa na presença na dengue, a dor é muito mais pronunciada e localizada nas articulações e tendões nos casos de febre chikungunya.

Sensor identifica insetos pela frequência do batimento das asas

07/07/2014

Por Elton Alisson
Agência FAPESP – Os serviços de vigilância à saúde de países como o Brasil poderão contar em alguns anos com uma tecnologia para identificar focos de mosquitos transmissores de doenças como a dengue, a malária e a febre amarela, de forma mais rápida, barata e precisa.

Um grupo de pesquisadores do Laboratório de Inteligência Computacional do Instituto de Ciências Matemáticas e de Computação (ICMC) da Universidade de São Paulo (USP), campus de São Carlos, desenvolveu – em parceria com colegas do Bourns College of Engineering da University of California Riverside (UCR) e da filial norte-americana da empresa brasileira Isca Tecnologias – um sensor capaz de identificar e quantificar automaticamente diferentes espécies de insetos voadores causadores de doenças ou pragas agrícolas.

Desenvolvido na USP de São Carlos, dispositivo identifica mosquitos transmissores da dengue e da febre amarela, além de pragas agrícolas, de forma mais rápida, barata e precisa (fotos: Reinaldo Mizutani)

Resultado de um projeto realizado com apoio da FAPESP, da Fundação Bill & Melinda Gates e da Vodafone Americas Foundation, o sensor foi descrito em um artigo publicado na edição de junho do Journal of Insect Behavior.

“O sensor permite monitorar populações de insetos nocivos à saúde humana ou que causam danos à agricultura e ao meio ambiente de uma forma muito mais rápida, precisa e inteligente”, disse Gustavo Enrique de Almeida Prado Alves Batista, professor do ICMC e coordenador do projeto, à Agência FAPESP.
“Em vez de pulverizar inseticida sobre toda uma região onde se estima que uma determinada espécie de inseto voador nocivo à saúde ou às lavouras esteja presente, é possível aplicá-lo somente nas áreas identificadas como focos do inseto pelo sensor”, avaliou.

O aparelho começou a ser desenvolvido em 2010, quando Batista iniciou o pós-doutorado na UCR, com Bolsa da FAPESP, e uma colaboração com o grupo de Eamonn John Keogh, professor de Ciência da Computação da universidade norte-americana, e com Agenor Mafra-Neto, pesquisador principal da Isca Tecnologias.
Na época, Keogh estava interessado em desenvolver um sistema de classificação automática de insetos baseado em técnicas de reconhecimento de voz e aprendizado de máquina – área da inteligência artificial voltada ao desenvolvimento de algoritmos (sequências de comandos) e técnicas que permitem ao computador aperfeiçoar seu desempenho na execução de tarefas.

A solução desenvolvida por Batista em parceria com o grupo de Keogh foi um sensor a laser baseado na análise da frequência sonora do batimento de asas de insetos durante o voo.
“Os insetos voadores batem as asas em velocidades diferentes, de acordo com seu tamanho e outras características morfológicas, e em frequências sonoras que variam tipicamente entre 100 e 1.500 Hertz”, explicou Batista.
“Nossa ideia foi desenvolver um sistema que identificasse a frequência sonora em que diferentes insetos voadores batem as asas, além de outros dados, para classificá-los”, disse.

Funcionamento do sensor

O sensor desenvolvido pelos pesquisadores é composto por um feixe de laser de baixa potência direcionado para uma matriz com uma série de fototransistores – como uma ponteira a laser apontada para uma parede.
Ao voar entre o feixe de laser e a matriz com fototransistores, as asas de um inseto voador bloqueiam parcialmente e causam pequenas variações na luz.
As oscilações na luz provocadas pelas asas do inseto voador são capturadas pela fototransistor matriz como sinais similares aos de áudio – como os capturados por um microfone convencional, com a diferença de que não são originários de variação nas ondas sonoras, mas da variação da luz.
Os sinais extraídos pelo sensor são filtrados e amplificados por meio de uma placa de circuitos eletrônicos. Com um gravador de som digital conectado à saída da placa é possível registrar os sinais em arquivos de áudio e transferi-los para um computador a fim de analisá-los

“Cada espécie de inseto voador produz um sinal ligeiramente diferente da outra. Isso possibilita comparar computacionalmente os sinais de cada uma das diferentes espécies”, disse Batista.
Os dados para calibração e classificação de espécies pelo sensor foram coletados por meio da colocação dos insetos em caixas de acrílico contendo sensores acoplados e com luminosidade, temperatura e umidade controladas.
Cada uma das caixas com o sensor recebeu dezenas de insetos voadores pré-classificados como pertencentes a uma única espécie. Entre elas os mosquitos Aedes aegypti (transmissor da dengue e da febre amarela), Anopheles gambiae (vetor da malária), Culex quinquefasciatus (vetor da filariose linfática) e Culex tarsalis (vetor da encefalite de Saint Louis e da encefalite equina ocidental), além das espécies de mosca Drosophila melanogaster (conhecida popularmente como mosca da banana), a Musca domestica, a Psychodidae dípteros (conhecida como mosca do banheiro), o escaravelho Cotinis mutabilis e a abelha Apis mellifera.
Após 15 dias de coletas de dados, os pesquisadores registraram os sinais gerados pela simples passagem dos insetos pelo feixe de laser do sensor dentro das caixas acrílicas, descartando qualquer ruído de fundo. Os sinais obtidos pelos sensores nas diferentes caixas com insetos foram gravados misturados em um único arquivo.
Ao submeter o arquivo de áudio para análise de um software com um algoritmo de classificação, também desenvolvido pelos pesquisadores, o sistema computacional foi capaz de diferenciar e identificar as espécies de insetos com uma porcentagem de acerto que variou entre 98% e 99%.

“Atualmente só estamos explorando a frequência de batimento de asas e outros atributos intrínsecos ao sinal no sensor”, disse Batista. “Há outras variáveis que podem ser adicionadas para melhorar ainda mais a taxa de sucesso do sensor na identificação de espécies de insetos.”
Entre essas variáveis estão o momento durante o dia em que os insetos voam, além de temperatura, pressão e umidade do ar ambiente – os três fatores meteorológicos que mais afetam a atividade dos insetos.
Estima-se que a elevação da temperatura provoque mudanças no metabolismo e aumente a frequência de batimento de asas dos insetos, contou Batista.

Por meio de uma pesquisa realizada pelo doutorando Vinícius Mourão Alves de Souza, também com Bolsa da FAPESP, os pesquisadores estudam como o sinal obtido pelo sensor varia conforme as condições ambientais em que estão os insetos. “Queremos avaliar como o sensor funciona sob diferentes condições de temperatura, umidade e pressão do ar”, disse Batista.
Já por meio de uma pesquisa realizada por Diego Furtado Silva, também com Bolsa da FAPESP, os pesquisadores extraíram outros dados (atributos) dos sinais que podem fornecer mais informações além da frequência de batimento de asas.
“Estamos utilizando uma série de técnicas baseadas principalmente em reconhecimento de voz para extrair melhores atributos do que somente a frequência do batimento de asas”, contou Batista.
Armadilha inteligente

O sensor a laser foi utilizado em um protótipo de armadilha inteligente desenvolvida pelos pesquisadores do ICMC em colaboração com a filial da Isca Tecnologias em Riverside.
O dispositivo é capaz de identificar insetos voadores em tempo real, por meio do sensor de laser, capturar espécies-alvos, como as transmissoras de doenças ou pragas agrícolas, e permitir que outros insetos não nocivos, como abelhas e outros insetos polinizadores ou fontes de alimentos para outros animais, sejam lançados de volta para o meio ambiente.

“Desde que começamos a desenvolver o sensor já tínhamos a ideia de utilizá-lo em uma aplicação prática, como uma armadilha inteligente de insetos”, disse Batista.
A armadilha tem formato cilíndrico e é composta por um tubo de ABS com o sensor a laser acoplado em sua entrada e a um saco coletor em sua saída – como um aspirador de pó.
O equipamento conta com uma válvula na entrada que libera dióxido de carbono – substância capaz de atrair as fêmeas de muitas espécies de mosquitos.

Ao voar diante da entrada da armadilha, o inseto é sugado por um fluxo de ar gerado por uma ventoinha como a de um computador em direção a uma câmara onde está o sensor a laser para ser classificado.
Se identificado como espécie não nociva, uma porta de saída é aberta e o inseto é empurrado para fora da armadilha por meio da inversão da direção do fluxo de ar.
Já se for identificado como espécie nociva, o inseto é empurrado pelo fluxo de ar para o saco coletor, onde fica retido em um papel adesivo semelhante ao utilizado nas armadilhas adesivas convencionais que não são seletivas – ou seja, capturam todas as espécies de insetos, inclusive as não nocivas.
“A armadilha permite identificar e quantificar com maior facilidade e precisão a presença de insetos indesejáveis em uma determinada área”, avaliou Batista.
“Desta forma, é possível monitorar em tempo real a população de insetos nocivos em uma determinada região e reportar esses dados por meio de redes sem fio para as agências de vigilância sanitária”, afirmou.

Baixo custo

Os pesquisadores estimam que o sensor tem potencial para ser amplamente utilizado em razão do baixo custo de produção – menos de R$ 30 – e por ser alimentado por energia solar ou uma bateria.
Na área da saúde, uma das principais aplicações pode estar no combate aos mosquitos do gênero Anopheles, vetores da malária, e do gênero Aedes, transmissores da dengue e da febre amarela.
Um das principais estratégias para combater a dengue, segundo Batista, é acompanhar os casos de notificação da doença para estimar os possíveis focos do mosquito transmissor e, posteriormente, realizar ações de pulverização de inseticida e conscientização da população. O problema, de acordo com ele, é que o tempo para a notificação da doença e a implementação da campanha é muito longo.
“Esse intervalo entre a notificação da doença e o início da campanha de pulverização pode ser de duas a três semanas ou mais. Isso representa mais do que o tempo de vida de um mosquito adulto”, afirmou.
“A vantagem do sensor que desenvolvemos é que ele permite identificar onde o inseto está presente e estimar a população dele em tempo real”, avaliou.

O artigo “Flying insect classification with inexpensive sensors” (doi: 10.1007/s10905-014-9454-4), de Batista e outros, pode ser lido por assinantes do Journal of Insect Behavior em http://link.springer.com/article/10.1007/s10905-014-9454-4

Pesquisa traça história evolutiva do vírus da dengue tipo 2 no Brasil

19/04/2013

Por Karina Toledo
Agência FAPESP – Uma pesquisa publicada na revista PLoS One mapeou, no Brasil, a história evolutiva do sorotipo 2 do vírus da dengue (DENV-2) – uma das quatro espécies transmitidas ao homem pelo mosquito Aedes aegypti .

Os resultados revelam a circulação simultânea de diferentes linhagens de DENV-2 no país, o que pode estar associado a um maior número de surtos epidêmicos e de manifestações graves da doença quando comparado aos outros três sorotipos da dengue. A existência de uma maior variabilidade genética entre o DENV-2 também tem sido apontada como causa do insucesso em testes com vacinas.

Resultados indicam grande variabilidade genética e circulação simultânea de diferentes linhagens, o que eleva o risco de surtos epidêmicos e dificulta a criação de vacinas (célula do vetor infectada com o vírus da dengue tipo 2/foto:Monika Barth/IOC) 

Para mapear a diversidade filogenética e filogeográfica do vírus, ou seja, o caminho evolutivo trilhado em diferentes regiões do país, pesquisadores da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (Famerp), da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) e do Massachusetts Institute of Technology (MIT), nos Estados Unidos, realizaram o sequenciamento completo de 12 amostras de DENV-2 de pacientes atendidos em São José do Rio Preto durante a epidemia de 2008. Os dados foram comparados com amostras de bancos de dados genéticos de dengue do Brasil e do mundo.

O trabalho foi coordenado por Mauricio Lacerda Nogueira, do Laboratório de Pesquisas em Virologia da Famerp, e contou com financiamento da FAPESP e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Fapemig) e apoio da Secretaria de Saúde de São José do Rio Preto e do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT) em Dengue.

“Dentro de cada uma das quatro espécies de vírus causadoras da dengue existem diferentes genótipos. Dentro de cada genótipo ainda há variações genéticas que chamamos de clados ou linhagens. Nossos dados mostram que três diferentes linhagens de DENV-2 entraram no Brasil nos últimos 30 anos e todas elas pertencem ao genótipo Americano/Asiático”, disse Nogueira.

Segundo o pesquisador, há ao todo seis diferentes genótipos do DENV-2. O genótipo Americano/Asiático, que estima-se teria vindo do Vietnã via Cuba, predomina hoje em todo o continente americano. “O genótipo Americano existente na região originalmente foi expulso por uma versão do vírus oriunda da Ásia, mais agressiva e mais adaptada às condições epidemiológicas das Américas”, explicou.
As três diferentes linhagens de DENV-2 analisadas no estudo foram chamadas pelos pesquisadores de BR1, BR2 e BR3. Diferem geneticamente entre si por 37 alterações de aminoácidos. Essas variações, segundo Nogueira, encontram-se na região do genoma do vírus que mais interage com o sistema imunológico humano.

Os resultados divulgados na PLos One indicam que a primeira introdução do genótipo Americano/Asiático teria ocorrido entre 1988 e 1989, possivelmente no Rio de Janeiro. Essa linhagem, batizada de BR1,teria circulado continuamente em diferentes regiões do país por pelo menos 14 anos.
Entre 1998 e 2000 teria ocorrido a introdução da linhagem BR2, mais restrita à região Nordeste do país. Paralelamente, em 1999, o BR3 teria aparecido no Sudeste e, em 2001, na região Norte, causando grandes epidemias no Rio de Janeiro e em São Paulo entre 2007 e 2008 e superando as outras duas linhagens em termos de número de casos e de manifestações graves.

Presença constante

“Fizemos um estudo semelhante com o DENV-1, publicado em 2012 na revista Archives of Virology, no qual mostramos que, quando uma nova linhagem do vírus emergia, a anterior desaparecia completamente. Mas, no caso do DENV-2, existem períodos em que há dois clados diferentes circulando ao mesmo tempo no país, o que torna esse vírus mais perigoso. A maior variabilidade genética favorece epidemias”, disse Nogueira.

Não é por coincidência, afirmou o pesquisador, que o DENV-2 é há pelo menos dez anos uma presença constante no interior de São Paulo, enquanto os demais sorotipos causam epidemias em anos específicos e depois desaparecem por longos períodos. “Ao analisar os dados do Ministério da Saúde é possível detectar dengue do tipo 2 todos os anos no Brasil e em diferentes regiões”, disse.
Há alguns anos, o consenso entre os especialistas era de que, uma vez afetado por um sorotipo da dengue, o indivíduo ficaria imune àquela espécie do vírus, mesmo se infectado por diferentes genótipos e linhagens. Mas estudos recentes têm levantado novos questionamentos entre os cientistas.
Em artigo publicado na The Lancet em 2012, pesquisadores do laboratório Sanofi Pasteur reportaram o sucesso apenas parcial da vacina tetravalente contra a dengue testada em 4 mil crianças com idades entre 4 e 11 anos na Tailândia.

Entre os sorotipos DENV-1, DENV-3 e DENV-4, a taxa de eficiência ficou entre 60% e 90%. Mas o sorotipo DEN-2 resistiu quase que totalmente aos efeitos da vacina. Uma das razões apontadas no estudo seria a diferença entre os clados circulantes na população da Tailândia e os usados para fazer o imunizante.

Outros testes com a vacina da Sanofi estão em andamento em dez países da Ásia e da América Latina, entre eles o Brasil, com 31 mil crianças e adolescentes.
“Não sabemos se os resultados brasileiros serão parecidos com os da Tailândia. Pode ser, por exemplo, que aqui a vacina funcione contra o DENV-2 e não funcione contra o DENV-4. Precisamos de mais estudos para entender a evolução dos quatro sorotipos, as variações de linhagem e o quanto isso importa em termos de resposta imune, do número de casos e da gravidade da doença”, afirmou Nogueira.
Para o pesquisador, no entanto, o mais provável é que os resultados apontem para a necessidade de desenvolver vacinas específicas para cada país e para cada região.
“Temos de conhecer exatamente qual tipo de vírus está circulando em um local para saber o tipo de vacina que precisamos. Assim como não é possível fazer uma vacina genérica contra a gripe, talvez tenhamos que fazer vacinas diferentes contra a dengue. Mas precisamos de mais dados dos ensaios em andamento para saber ao certo”, ponderou.

Nogueira também coordena, com apoio da FAPESP e da prefeitura de São José do Rio Preto, um projeto de vigilância em dengue para acompanhar em tempo real o que acontece no município, que atualmente enfrenta uma forte epidemia.
“Já foram registrados mais de 8 mil casos somente em 2013 e nossos dados indicam que mais de 90% correspondem ao DENV-4, que aparentemente é menos agressivo. O número de casos graves não está sendo grande”, contou.

Entre 2009 e 2010, a região enfrentou uma epidemia de DENV-1 com mais de 20 mil casos. Com epidemias tão próximas causadas por diferentes vírus e a presença constante do DENV-2, o risco de a população sofrer infecções repetidas aumenta, o que eleva também o risco de manifestações graves, alertou o pesquisador.

O artigo Circulation of Different Lineages of Dengue Virus 2, Genotype American/Asian in Brazil: Dynamics and Molecular and Phylogenetic Characterization (doi: 10.1371/journal.pone.0059422) pode ser lido em www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0059422