Como as bactérias se defendem de oxidantes
Pesquisadores identificaram substratos biológicos de enzima bacteriana
Pesquisa realizada pelo CEPID REDOXOMA, financiado pela FAPESP (http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/58576/redoxoma/)
revelou novos aspectos relacionados ao mecanismo de ação da enzima
chamada Ohr (proteína de resistência a hidroperóxidos orgânicos, na
sigla em inglês), que confere a diversas espécies de bactérias a
capacidade de neutralizar substâncias oxidantes liberadas pelo sistema
de defesa do organismo hospedeiro – seja ele planta ou animal.
A pesquisa contou com pesquisadores do Brasil e do exterior, dentre eles o Prof. Marcos A. de Oliveira do Instituto de Biociências da Unesp- Câmpus do Litoral Paulista, e os resultados foram divulgados recentemente na revista Proceedings of the National Academy of Sciences (http://www.pnas.org/content/114/2/E132) . Segundo os autores, o conhecimento pode abrir caminho para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para doenças causadas por microrganismos em plantas e animais.
De acordo com Luis Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo: “Não há em plantas ou em animais nenhuma proteína conhecida com estrutura semelhante à da Ohr. Isso sugere que é possível inibir essa enzima na bactéria sem causar grandes prejuízos ao organismo infectado e, por isso, ela se torna um alvo interessante para o desenvolvimento de fármacos”, afirmou o professor do Instituto de Biociências (IB-USP) Luis Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo. Ressaltando que ainda faltam dados que liguem Ohr a virulência/patogenicidade de bactérias.
“Quando começamos a investigação, já sabíamos que a Ohr tinha função antioxidante, mas não eram conhecidos os substratos fisiológicos dessa enzima. Nós mostramos neste estudo que ela neutraliza preferencialmente peróxidos – particularmente os hidroperóxidos de ácidos graxos de cadeia longa e o peroxinitrito”, disse Netto.
Segundo Marcos A. de Oliveira, da Unesp - CLP: “Determinamos a estrutura em nível atômico desta proteína o que forneceu subsídios para que pudéssemos entender um pouco mais de seu funcionamento e de moléculas envolvidas na resistência desta bactéria nos hospedeiros. De fato, a estrutura da proteína revelou uma molécula no sitio ativo de Ohr (local utilizado para detoxificar substancias danosas a bactéria) o que nos deu uma ideia de substratos biológicos.”
Em seguida autores do trabalho fizeram os chamados testes de ancoragem molecular (“docking”)– por simulação computacional que mostra o encaixe dos possíveis substratos ao sítio ativo da enzima. Essas análises mostraram grande complementariedade estrutural entre a Ohr e diferentes tipos de hidroperóxidos de ácidos graxos, como os derivados do ácido araquidônico e do ácido linoleico, substâncias que atuam como mediadores de processos inflamatórios em mamíferos e em plantas, respectivamente.
A esquerda está representada a estrutura da proteína Ohr determinada pelo grupo de pesquisa em que foi encontrada um ligante (polietileno glicol) no sitio ativo da enzima (representado em verde, branco e vermelho). A direita é mostrada o resultado de ancoragem molecular onde os hidroperóxidos se ligam especificamente ao sitio ativo da enzima.
Para validar estas descobertas, foram feitos ensaios in vitro com a proteína Ohr produzida pela Xylella fastidiosa bactéria causadora da doença clorose variegada dos citros (CVC) ou “amarelinho”, que ataca a laranja. Conforme explicou Netto, o trabalho é um desdobramento do projeto genoma (http://www.bv.fapesp.br/linha-do-tempo/1206/genoma-xylella/) realizado nos anos 1990, com apoio da FAPESP, para sequenciar o genoma da X. fastidiosa.
Nos testes in vitro, os cientistas incubaram a Ohr purificada com diversos tipos de hidroperóxidos. O objetivo foi medir o tempo necessário para a enzima transformar cada um desses oxidantes em substâncias menos tóxicas. “Observamos, por exemplo, que ela consegue neutralizar o peróxido de hidrogênio [água oxigenada], mas o processo é 100 mil vezes mais lento do que no caso do hidroperóxido de ácido araquidônico”, contou Netto.
Uma surpresa para o grupo nessa etapa foi observar que, em contato com o peroxinitrito, a enzima agia com a mesma eficiência observada com os hidroperóxidos de ácido araquidônico e o ácido linoleico – algo não previsto nas simulações computacionais.
“O peroxinitrito é um produto formado por dois outros radicais: o superóxido e o óxido nítrico. É liberado tanto por plantas quanto mamíferos em resposta à infecção por patógenos”, explicou o pesquisador.
O passo seguinte foi a realização de ensaios microbiológicos e, para isso, o grupo do IB-USP usou com linhagens de bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa, que em humanos é responsável por causar infecções oportunistas, no trato respiratório, urinário e ouvido no homem.
“Comparamos um grupo de bactérias mutantes, que tiveram o gene da Ohr deletado, com bactérias selvagens [capazes de produzir a enzima]. Os dois grupos foram colocados em diferentes concentrações de hidroperóxidos para testar sua resistência”, contou Netto. Enquanto as bactérias selvagens conseguiam crescer mesmo em altas concentração de hidroperóxidos, as linhagens mutantes paravam de se multiplicar mesmo nas doses mais baixas. Porém, quando o gene da Ohr foi inserido na linhagem mutante, essas bactérias voltaram a mostrar resistência aos oxidantes comparável as células selvagens.
Os testes feitos na USP mostraram que outras bactérias mutantes sem essas outras enzimas antioxidantes não apresentaram a mesma sensibilidade aos hidroperóxidos de ácidos graxos e ao peroxinitrito que a observada na linhagem mutante sem Ohr. Na avaliação dos pesquisadores, esse dado sugere que a Ohr tem papel central na defesa antioxidante bacteriana.
Segundo os pesquisadores: “Estes resultados são bastante importantes, pois dentre os organismos que possuem esta proteína estão diversos patógenos a família Xanthomonadaceae responsáveis por doenças infeciosas em culturas de plantas de importância econômica e social como alfafa, algodão, amêndoa, arroz, café, laranja, pêssego, pêra, uva, entre outras, como também em animais e humanos também como Actinobacillus pleuropneumoniae (pneumonia em suínos), Francisella tularensis (tularemia em humanos), Mycoplasma genitalium (infeções no trato genital e urinário em humanos).
Neste contexto, o entendimento do funcionamento e dos substratos da enzima pode levar a descoberta de novos quimioterápicos para auxiliar no tratamento de doenças em que os patógenos possuem a proteína Ohr”.
Além dos pesquisadores mencionados também participaram do trabalho Thiago Alegria, autor principal, José Renato Cussiol e Diogo Meireles, todos com projetos de pós-graduação orientados pelo Prof. Netto e vinculados ao Centro de Pesquisa em Processos Redox em Biomedicina (Redoxoma); os pesquisadores do Instituto de Quimica da USP- SP Paolo Di Mascio, Sayuri Miyamoto, Raphael F. Queiroz e Ohara Augusto (coordenadora do CEPID Redoxoma); Napolea?o Fonseca Valadares e Richard C. Garratt do Instituto de Física da USP São Carlos; Rafael Radi, Martín Hugo, Madia Trujillo da Universidad de la Repu?blica do Uruguai (UDELAR).
Marcos Antonio de Oliveira
Lab. Biologia Molecular Estrutural
Instituto de Biociências
A pesquisa contou com pesquisadores do Brasil e do exterior, dentre eles o Prof. Marcos A. de Oliveira do Instituto de Biociências da Unesp- Câmpus do Litoral Paulista, e os resultados foram divulgados recentemente na revista Proceedings of the National Academy of Sciences (http://www.pnas.org/content/114/2/E132) . Segundo os autores, o conhecimento pode abrir caminho para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para doenças causadas por microrganismos em plantas e animais.
De acordo com Luis Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo: “Não há em plantas ou em animais nenhuma proteína conhecida com estrutura semelhante à da Ohr. Isso sugere que é possível inibir essa enzima na bactéria sem causar grandes prejuízos ao organismo infectado e, por isso, ela se torna um alvo interessante para o desenvolvimento de fármacos”, afirmou o professor do Instituto de Biociências (IB-USP) Luis Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo. Ressaltando que ainda faltam dados que liguem Ohr a virulência/patogenicidade de bactérias.
“Quando começamos a investigação, já sabíamos que a Ohr tinha função antioxidante, mas não eram conhecidos os substratos fisiológicos dessa enzima. Nós mostramos neste estudo que ela neutraliza preferencialmente peróxidos – particularmente os hidroperóxidos de ácidos graxos de cadeia longa e o peroxinitrito”, disse Netto.
Segundo Marcos A. de Oliveira, da Unesp - CLP: “Determinamos a estrutura em nível atômico desta proteína o que forneceu subsídios para que pudéssemos entender um pouco mais de seu funcionamento e de moléculas envolvidas na resistência desta bactéria nos hospedeiros. De fato, a estrutura da proteína revelou uma molécula no sitio ativo de Ohr (local utilizado para detoxificar substancias danosas a bactéria) o que nos deu uma ideia de substratos biológicos.”
Em seguida autores do trabalho fizeram os chamados testes de ancoragem molecular (“docking”)– por simulação computacional que mostra o encaixe dos possíveis substratos ao sítio ativo da enzima. Essas análises mostraram grande complementariedade estrutural entre a Ohr e diferentes tipos de hidroperóxidos de ácidos graxos, como os derivados do ácido araquidônico e do ácido linoleico, substâncias que atuam como mediadores de processos inflamatórios em mamíferos e em plantas, respectivamente.
A esquerda está representada a estrutura da proteína Ohr determinada pelo grupo de pesquisa em que foi encontrada um ligante (polietileno glicol) no sitio ativo da enzima (representado em verde, branco e vermelho). A direita é mostrada o resultado de ancoragem molecular onde os hidroperóxidos se ligam especificamente ao sitio ativo da enzima.
Para validar estas descobertas, foram feitos ensaios in vitro com a proteína Ohr produzida pela Xylella fastidiosa bactéria causadora da doença clorose variegada dos citros (CVC) ou “amarelinho”, que ataca a laranja. Conforme explicou Netto, o trabalho é um desdobramento do projeto genoma (http://www.bv.fapesp.br/linha-do-tempo/1206/genoma-xylella/) realizado nos anos 1990, com apoio da FAPESP, para sequenciar o genoma da X. fastidiosa.
Nos testes in vitro, os cientistas incubaram a Ohr purificada com diversos tipos de hidroperóxidos. O objetivo foi medir o tempo necessário para a enzima transformar cada um desses oxidantes em substâncias menos tóxicas. “Observamos, por exemplo, que ela consegue neutralizar o peróxido de hidrogênio [água oxigenada], mas o processo é 100 mil vezes mais lento do que no caso do hidroperóxido de ácido araquidônico”, contou Netto.
Uma surpresa para o grupo nessa etapa foi observar que, em contato com o peroxinitrito, a enzima agia com a mesma eficiência observada com os hidroperóxidos de ácido araquidônico e o ácido linoleico – algo não previsto nas simulações computacionais.
“O peroxinitrito é um produto formado por dois outros radicais: o superóxido e o óxido nítrico. É liberado tanto por plantas quanto mamíferos em resposta à infecção por patógenos”, explicou o pesquisador.
O passo seguinte foi a realização de ensaios microbiológicos e, para isso, o grupo do IB-USP usou com linhagens de bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa, que em humanos é responsável por causar infecções oportunistas, no trato respiratório, urinário e ouvido no homem.
“Comparamos um grupo de bactérias mutantes, que tiveram o gene da Ohr deletado, com bactérias selvagens [capazes de produzir a enzima]. Os dois grupos foram colocados em diferentes concentrações de hidroperóxidos para testar sua resistência”, contou Netto. Enquanto as bactérias selvagens conseguiam crescer mesmo em altas concentração de hidroperóxidos, as linhagens mutantes paravam de se multiplicar mesmo nas doses mais baixas. Porém, quando o gene da Ohr foi inserido na linhagem mutante, essas bactérias voltaram a mostrar resistência aos oxidantes comparável as células selvagens.
Os testes feitos na USP mostraram que outras bactérias mutantes sem essas outras enzimas antioxidantes não apresentaram a mesma sensibilidade aos hidroperóxidos de ácidos graxos e ao peroxinitrito que a observada na linhagem mutante sem Ohr. Na avaliação dos pesquisadores, esse dado sugere que a Ohr tem papel central na defesa antioxidante bacteriana.
Segundo os pesquisadores: “Estes resultados são bastante importantes, pois dentre os organismos que possuem esta proteína estão diversos patógenos a família Xanthomonadaceae responsáveis por doenças infeciosas em culturas de plantas de importância econômica e social como alfafa, algodão, amêndoa, arroz, café, laranja, pêssego, pêra, uva, entre outras, como também em animais e humanos também como Actinobacillus pleuropneumoniae (pneumonia em suínos), Francisella tularensis (tularemia em humanos), Mycoplasma genitalium (infeções no trato genital e urinário em humanos).
Neste contexto, o entendimento do funcionamento e dos substratos da enzima pode levar a descoberta de novos quimioterápicos para auxiliar no tratamento de doenças em que os patógenos possuem a proteína Ohr”.
Além dos pesquisadores mencionados também participaram do trabalho Thiago Alegria, autor principal, José Renato Cussiol e Diogo Meireles, todos com projetos de pós-graduação orientados pelo Prof. Netto e vinculados ao Centro de Pesquisa em Processos Redox em Biomedicina (Redoxoma); os pesquisadores do Instituto de Quimica da USP- SP Paolo Di Mascio, Sayuri Miyamoto, Raphael F. Queiroz e Ohara Augusto (coordenadora do CEPID Redoxoma); Napolea?o Fonseca Valadares e Richard C. Garratt do Instituto de Física da USP São Carlos; Rafael Radi, Martín Hugo, Madia Trujillo da Universidad de la Repu?blica do Uruguai (UDELAR).
Contato do pesquisador
Marcos Antonio de Oliveira
Lab. Biologia Molecular Estrutural
Instituto de Biociências
Unesp - Câmpus do Litoral Paulista
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