Pesquisa realizada pelo CEPID REDOXOMA, financiado pela FAPESP (
http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/58576/redoxoma/)
revelou novos aspectos relacionados ao mecanismo de ação da enzima
chamada Ohr (proteína de resistência a hidroperóxidos orgânicos, na
sigla em inglês), que confere a diversas espécies de bactérias a
capacidade de neutralizar substâncias oxidantes liberadas pelo sistema
de defesa do organismo hospedeiro – seja ele planta ou animal.
A
pesquisa contou com pesquisadores do Brasil e do exterior, dentre eles o
Prof. Marcos A. de Oliveira do Instituto de Biociências da Unesp-
Câmpus do Litoral Paulista, e os resultados foram divulgados
recentemente na revista
Proceedings of the National Academy of Sciences (
http://www.pnas.org/content/114/2/E132)
. Segundo os autores, o conhecimento pode abrir caminho para o
desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para doenças causadas
por microrganismos em plantas e animais.
De acordo com Luis
Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo: “Não há em plantas ou em
animais nenhuma proteína conhecida com estrutura semelhante à da Ohr.
Isso sugere que é possível inibir essa enzima na bactéria sem causar
grandes prejuízos ao organismo infectado e, por isso, ela se torna um
alvo interessante para o desenvolvimento de fármacos”, afirmou o
professor do Instituto de Biociências (IB-USP) Luis Eduardo Soares
Netto, coordenador do estudo. Ressaltando que ainda faltam dados que
liguem Ohr a virulência/patogenicidade de bactérias.
“Quando
começamos a investigação, já sabíamos que a Ohr tinha função
antioxidante, mas não eram conhecidos os substratos fisiológicos dessa
enzima. Nós mostramos neste estudo que ela neutraliza preferencialmente
peróxidos – particularmente os hidroperóxidos de ácidos graxos de cadeia
longa e o peroxinitrito”, disse Netto.
Segundo Marcos A. de
Oliveira, da Unesp - CLP: “Determinamos a estrutura em nível atômico
desta proteína o que forneceu subsídios para que pudéssemos entender um
pouco mais de seu funcionamento e de moléculas envolvidas na resistência
desta bactéria nos hospedeiros. De fato, a estrutura da proteína
revelou uma molécula no sitio ativo de Ohr (local utilizado para
detoxificar substancias danosas a bactéria) o que nos deu uma ideia de
substratos biológicos.”
Em seguida autores do trabalho fizeram os chamados testes de ancoragem molecular (“
docking”)–
por simulação computacional que mostra o encaixe dos possíveis
substratos ao sítio ativo da enzima. Essas análises mostraram grande
complementariedade estrutural entre a Ohr e diferentes tipos de
hidroperóxidos de ácidos graxos, como os derivados do ácido araquidônico
e do ácido linoleico, substâncias que atuam como mediadores de
processos inflamatórios em mamíferos e em plantas, respectivamente.
A
esquerda está representada a estrutura da proteína Ohr determinada pelo
grupo de pesquisa em que foi encontrada um ligante (polietileno glicol)
no sitio ativo da enzima (representado em verde, branco e vermelho). A
direita é mostrada o resultado de ancoragem molecular onde os
hidroperóxidos se ligam especificamente ao sitio ativo da enzima.
Para validar estas descobertas, foram feitos ensaios
in vitro com a proteína Ohr produzida pela
Xylella fastidiosa
bactéria causadora da doença clorose variegada dos citros (CVC) ou
“amarelinho”, que ataca a laranja. Conforme explicou Netto, o trabalho é
um desdobramento do projeto genoma
(http://www.bv.fapesp.br/linha-do-tempo/1206/genoma-xylella/) realizado
nos anos 1990, com apoio da FAPESP, para sequenciar o genoma da
X. fastidiosa.
Nos testes
in vitro,
os cientistas incubaram a Ohr purificada com diversos tipos de
hidroperóxidos. O objetivo foi medir o tempo necessário para a enzima
transformar cada um desses oxidantes em substâncias menos tóxicas.
“Observamos, por exemplo, que ela consegue neutralizar o peróxido de
hidrogênio [água oxigenada], mas o processo é 100 mil vezes mais lento
do que no caso do hidroperóxido de ácido araquidônico”, contou Netto.
Uma
surpresa para o grupo nessa etapa foi observar que, em contato com o
peroxinitrito, a enzima agia com a mesma eficiência observada com os
hidroperóxidos de
ácido araquidônico e o
ácido linoleico – algo não
previsto nas simulações computacionais.
“O peroxinitrito é um
produto formado por dois outros radicais: o superóxido e o óxido
nítrico. É liberado tanto por plantas quanto mamíferos em resposta à
infecção por patógenos”, explicou o pesquisador.
O passo seguinte
foi a realização de ensaios microbiológicos e, para isso, o grupo do
IB-USP usou com linhagens de bactérias da espécie
Pseudomonas aeruginosa, que em humanos é responsável por causar infecções oportunistas, no trato respiratório, urinário e ouvido no homem.
“Comparamos
um grupo de bactérias mutantes, que tiveram o gene da Ohr deletado,
com bactérias selvagens [capazes de produzir a enzima]. Os dois grupos
foram colocados em diferentes concentrações de hidroperóxidos para
testar sua resistência”, contou Netto. Enquanto as bactérias selvagens
conseguiam crescer mesmo em altas concentração de hidroperóxidos, as
linhagens mutantes paravam de se multiplicar mesmo nas doses mais
baixas. Porém, quando o gene da Ohr foi inserido na linhagem mutante,
essas bactérias voltaram a mostrar resistência aos oxidantes comparável
as células selvagens.
Os testes feitos na USP mostraram que outras
bactérias mutantes sem essas outras enzimas antioxidantes não
apresentaram a mesma sensibilidade aos hidroperóxidos de ácidos graxos e
ao peroxinitrito que a observada na linhagem mutante sem Ohr. Na
avaliação dos pesquisadores, esse dado sugere que a Ohr tem papel
central na defesa antioxidante bacteriana.
Segundo os
pesquisadores: “Estes resultados são bastante importantes, pois dentre
os organismos que possuem esta proteína estão diversos patógenos a
família Xanthomonadaceae responsáveis por doenças infeciosas em culturas
de plantas de importância econômica e social como alfafa, algodão,
amêndoa, arroz, café, laranja, pêssego, pêra, uva, entre outras, como
também em animais e humanos também como Actinobacillus pleuropneumoniae (pneumonia em suínos), Francisella tularensis (tularemia em humanos), Mycoplasma genitalium
(infeções no trato genital e urinário em humanos).
Neste contexto, o
entendimento do funcionamento e dos substratos da enzima pode levar a
descoberta de novos quimioterápicos para auxiliar no tratamento de
doenças em que os patógenos possuem a proteína Ohr”.
Além dos
pesquisadores mencionados também participaram do trabalho Thiago
Alegria, autor principal, José Renato Cussiol e Diogo Meireles, todos
com projetos de pós-graduação orientados pelo Prof. Netto e vinculados
ao Centro de Pesquisa em Processos Redox em Biomedicina (Redoxoma); os
pesquisadores do Instituto de Quimica da USP- SP Paolo Di Mascio, Sayuri
Miyamoto, Raphael F. Queiroz e Ohara Augusto (coordenadora do CEPID
Redoxoma); Napolea?o Fonseca Valadares e Richard C. Garratt do Instituto
de Física da USP São Carlos; Rafael Radi, Martín Hugo, Madia Trujillo
da Universidad de la Repu?blica do Uruguai (UDELAR).
Contato do pesquisador
Marcos Antonio de Oliveira
Lab. Biologia Molecular Estrutural
Instituto de Biociências
Unesp - Câmpus do Litoral Paulista
