Estudo ajuda a entender como as células de defesa combatem bactérias

04 de setembro de 2017

Karina Toledo | Agência FAPESP – Quando as células de defesa que patrulham o organismo humano deparam com uma bactéria potencialmente perigosa, determinados complexos proteicos intracelulares conhecidos como inflamassomas são acionados.

  

  Estudo da USP de Ribeirão Preto sugere que diferentes tipos de inflamassoma – complexo proteico responsável por iniciar a resposta inflamatória em macrófagos – podem se autorregular para amplificar o sinal da infecção

Esse processo é essencial para desencadear um processo inflamatório capaz de atrair para o local do confronto um verdadeiro exército de células imunes e, assim, barrar o avanço da infecção.
Entender como exatamente esses mecanismos de defesa funcionam é o objetivo de um Projeto Temático apoiado pela FAPESP e coordenado pelo professor Dario Simões Zamboni na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP).
Resultados recentes foram publicados em julho na revista Cell Reports. O trabalho é desenvolvido no âmbito do Centro de Pesquisa em Doenças Inflamatórias (CRID), um dos Centros de Pesquisa, Inovação e Difusão (CEPIDs) da FAPESP.

“Esse tipo de conhecimento básico pode ajudar, no futuro, a desenvolver novos métodos tanto para combater infecções quanto para evitar que ocorra uma inflamação exacerbada e lesiva ao organismo, como é o caso da sepse”, disse Zamboni à Agência FAPESP.

No trabalho mais recente, o grupo investigou a interação entre três diferentes tipos de inflamassoma que podem ser ativados em macrófagos – células que integram a linha de frente do sistema imune e são responsáveis por fagocitar (ingerir) potenciais invasores.

Um deles é acionado quando certas moléculas – que podem ou não ser componentes microbianos – furam a membrana do macrófago e causam a saída de potássio do meio intracelular, o que resulta na ativação de uma proteína conhecida como NLRP3.

O segundo tipo de inflamassoma entra em ação quando a célula de defesa detecta em seu citoplasma a presença de DNA de micróbios invasores, causando a ativação da proteína AIM2.

Já o terceiro tipo é induzido pela presença, no citoplasma do macrófago, de um componente bacteriano denominado LPS (lipopolissacarídeo bacteriano), existente em espécies de bactérias Gram-negativas – ao qual pertencem diversos agentes causadores de doença em humanos, como Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Pseudomonas e Legionella pneumophila. Neste terceiro caso, o processo inflamatório tem início graças à ativação da proteína caspase-11.

Embora sejam mediados por proteínas diferentes, os três inflamassomas, quando ativados, levam à produção de moléculas pró-inflamatórias, como a interleucina-1 beta (IL-1β) e a interleucina-18 (IL-18). São essas citocinas que alertam o sistema imune sobre a necessidade de enviar ao local seu exército – composto por neutrófilos, monócitos inflamatórios, linfócitos e outros tipos de leucócitos. Quando isso efetivamente acontece, surgem os sintomas típicos de inflamação: dor, calor, vermelhidão e edema.

“Até agora, predominava a ideia de que esses inflamassomas funcionavam de forma independente um do outro. Mas nós estamos mostrando que um pode regular a ativação do outro de modo a amplificar o sinal da infecção e induzir uma resposta inflamatória mais potente”, contou Zamboni.

Metodologia

Os experimentos que possibilitaram essa conclusão foram feitos in vitro, com culturas de macrófagos de camundongos e também in vivo, com infeções nos pulmões dos camundongos. Como modelo de infecção foi usada a bactéria Legionella pneumophila, agente causador de pneumonia e capaz de ativar múltiplos inflamassomas nos macrófagos.
“Observamos in vitro que, quando a quantidade de DNA bacteriano no interior da célula de defesa é muito pequena, o estímulo não é suficiente para que a proteína AIM2 consiga clivar [quebrar as ligações peptídicas] uma outra proteína chamada caspase-1 e, assim, ativar o inflamassoma de AIM2. Porém, a AIM2 consegue deixar a caspase-1 em sua forma ativa e, em conjunto, as duas proteínas atuam de modo a fazer um furo na membrana do macrófago, ativando o inflamassoma de NLRP3”, explicou o pesquisador.
Ainda segundo Zamboni, estudos anteriores já haviam sugerido que a proteína caspase-11, ao reconhecer o LPS no citoplasma do macrófago, também induz um dano na membrana que resulta na ativação do inflamassoma de NLRP3.
“Agora, mostramos que também o inflamassoma de AIM2 consegue amplificar os sinais da infecção e acionar o inflamassoma de NLRP3 de forma não convencional”, acrescentou.
Ao repetir o experimento em células modificadas para não expressar as proteínas AIM2 e caspase-11, os pesquisadores observaram que não ocorria a ativação do inflamassoma de NLRP3 na presença da bactéria no meio de cultura e a célula se tornava completamente incapaz de orquestrar uma resposta inflamatória.

“Quando deixávamos uma das duas vias funcionando – AIM2 ou caspase-11 – a resposta ocorria, mas de forma menos eficiente que na célula selvagem”, contou Zamboni.
Em seguida, experimentos com camundongos foram feitos para confirmar se um efeito semelhante seria observado in vivo, situação em que há interação entre diversos fatores imunológicos.
Um dos grupos de estudo era formado por animais “selvagens”, sem alteração genética. O outro contava com roedores modificados para não produzir as proteínas AIM2 e caspase-11.
“Quando o camundongo selvagem respira a bactéria, todas as vias de ativação de inflamassoma são acionadas, uma resposta eficiente é articulada e a infecção, controlada. Já nos animais deficientes de AIM2 e caspase-11, durante os primeiros dois dias de infecção a bactéria consegue se replicar cerca de cinco a 10 vezes mais nos pulmões dos camundongos”, disse o pesquisador.
Na avaliação de Zamboni, há evidências de que, ao longo da evolução, o sistema imune de mamíferos foi desenvolvendo múltiplos mecanismos para reconhecer diferentes elementos de micróbios patogênicos e, assim, ativar o inflamassoma de NLRP3, garantindo a indução de uma resposta inflamatória.

“Reconhecer um micróbio com potencial para causar dano é o primeiro e um dos mais importantes processos que as células de defesa têm de fazer. Estamos em contato com milhares de microrganismos o tempo todo e a maioria deles não representa uma ameaça. Montar uma resposta inflamatória contra micróbios patogênicos é importante, mas custoso para o organismo. É preciso valer a pena”, afirmou Zamboni.
O artigo AIM2 Engages Active but Unprocessed Caspase-1 to Induce Noncanonical Activation of the NLRP3 Inflammasome, que foi destaque de capa da edição de julho da revista Cell reports, pode ser lido em: http://www.cell.com/cms/attachment/2101958419/2080115172/cover.tif.jpg.

Enzima ajuda bactérias a se defenderem de oxidantes gerados pelo sistema imune

03 de fevereiro de 2017

Karina Toledo  |  Agência FAPESP – Uma pesquisa apoiada pela FAPESP e conduzida na Universidade de São Paulo (USP) em colaboração com outras instituições de pesquisa nacionais e internacionais, revelou novos aspectos relacionados ao mecanismo de ação da enzima Ohr (proteína de resistência a hidroperóxidos orgânicos, na sigla em inglês), que confere a diversas espécies de bactérias a capacidade de neutralizar substâncias oxidantes liberadas pelo sistema de defesa do organismo hospedeiro – seja ele planta ou animal.

Em pesquisa publicada na PNAS, pesquisadores do Cepid Redoxoma identificaram substratos biológicos da enzima bacteriana Ohr, um potencial alvo para o desenvolvimento de novos fármacos (Figura: Docking molecular de hidroperóxidos de cadeia longa no sítio ativo da Ohr/Thiago G. P. Alegria, et al.)

Os resultados foram divulgados recentemente na revista Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS). Segundo os autores, o conhecimento pode possibilitar novas abordagens terapêuticas.

“Não há em plantas ou em animais nenhuma proteína conhecida com estrutura semelhante à da Ohr. Isso sugere que é possível inibir essa enzima na bactéria sem causar grandes prejuízos ao organismo infectado e, por isso, ela se torna um alvo interessante para o desenvolvimento de fármacos”, afirmou o professor do Instituto de Biociências (IB-USP) Luis Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo.
O pesquisador ressaltou, no entanto, que ainda faltam dados que relacionem a presença da Ohr com a virulência dos patógenos.

Diversos experimentos foram feitos pela equipe de Netto para entender como a Ohr participa da defesa antioxidante de bactérias, muitas delas patogênicas. Parte da investigação foi conduzida durante o mestrado de Thiago Alegria, o doutorado de José Renato Cussiol e o pós-doutorado de Diogo Meireles – todos bolsistas da FAPESP. Os projetos estão vinculados ao Centro de Pesquisa em Processos Redox em Biomedicina (Redoxoma), um dos Centros de Pesquisa, Inovação e Difusão (CEPIDs) apoiados pela Fundação.

“Quando começamos a pesquisa, já sabíamos que a Ohr tinha função antioxidante, mas não eram conhecidos os substratos fisiológicos dessa enzima. Nós mostramos neste estudo que ela neutraliza preferencialmente peróxidos – particularmente os hidroperóxidos de ácidos graxos de cadeia longa – e o peroxinitrito”, contou Netto.

Para chegar a essa conclusão, os pesquisadores fizeram inicialmente os chamados testes de ancoragem molecular (docking). Por simulação computacional foi possível ver o encaixe dos possíveis substratos ao sítio ativo da enzima. Essas análises mostraram grande complementariedade estrutural entre a Ohr e diferentes tipos de hidroperóxidos de ácidos graxos, como os derivados do ácido araquidônico e do ácido linoleico, substâncias que atuam como mediadores de processos inflamatórios em mamíferos e em plantas, respectivamente.

Para validar esse primeiro achado, foram feitos ensaios bioquímicos in vitro com a proteína Ohr produzida pela Xylella fastidiosa – bactéria causadora da doença clorose variegada dos citros (CVC) ou “amarelinho”, que ataca os citros. Conforme explicou Netto, o trabalho é um desdobramento do projeto realizado nos anos 1990, com apoio da FAPESP, para sequenciar o genoma da X. fastidiosa.
Nos testes in vitro, os cientistas incubaram a Ohr purificada com diversos tipos de hidroperóxidos. O objetivo foi medir o tempo necessário para a enzima transformar cada um desses oxidantes em substâncias menos tóxicas.

“Observamos, por exemplo, que ela consegue neutralizar o peróxido de hidrogênio [água oxigenada], mas o processo é 100 mil vezes mais lento do que no caso do hidroperóxido de ácido araquidônico”, contou Netto.

Segundo o pesquisador, a reação química ocorreu na escala de milissegundos quando a enzima foi incubada com os hidroperóxidos de ácidos graxos. Já com outros tipos de hidroperóxidos o processo ocorreu na escala de minutos.

Uma surpresa para o grupo nessa etapa foi observar que, em contato com o peroxinitrito, a enzima agia com a mesma eficiência observada com os hidroperóxidos de ácido araquidônico e o ácido linoleico – algo não previsto nas simulações computacionais.
“O peroxinitrito é um produto formado por dois outros radicais: o superóxido e o óxido nítrico. É liberado tanto por plantas quanto mamíferos em resposta à infecção por patógenos”, explicou o pesquisador.

Inibição do crescimento

O passo seguinte foi a realização de ensaios microbiológicos e, para isso, o grupo do IB-USP usou linhagens de bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa, que em humanos costuma causar infecções oportunistas, por exemplo, no sistema respiratório.

“Comparamos um grupo de bactérias mutantes, que tiveram o gene da Ohr deletado, com bactérias selvagens [capazes de produzir a enzima]. Os dois grupos foram colocados em diferentes concentrações de hidroperóxidos para testar sua resistência”, contou Netto.

Enquanto as bactérias selvagens conseguiam crescer mesmo em altas concentrações de hidroperóxidos, as linhagens mutantes paravam de se multiplicar mesmo nas doses mais baixas. Porém, quando o gene da Ohr foi inserido novamente na linhagem mutante, essas bactérias voltaram a mostrar resistência aos oxidantes em nível comparável ao das células selvagens.
Conforme explicou Netto, ao longo do processo evolutivo, as bactérias desenvolveram um grande repertório de proteínas antioxidantes para lidar com as defesas dos organismos hospedeiros – entre elas destacam-se as enzimas peroxirredoxinas e catalases.

Os testes feitos na USP mostraram que outras bactérias mutantes, com a deleção dessas outras enzimas antioxidantes, não apresentaram a mesma sensibilidade aos hidroperóxidos de ácidos graxos e ao peroxinitrito que a observada na linhagem mutante sem Ohr. Na avaliação de Netto, esse dado sugere que a Ohr tem papel central na defesa antioxidante bacteriana.

Peroxirredoxina

Em outro trabalho, publicado na revista Scientific Reports, o grupo de Netto em colaboração com o grupo do professor Marcos Antonio de Oliveira, da Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus Experimental do Litoral Paulista, estudou outra enzima antioxidante: a peroxirredoxina.
Essas proteínas são capazes de neutralizar muito rapidamente o peróxido de hidrogênio. Por serem muito abundantes e reativas, disse Netto, são consideradas os sensores celulares de peróxido de hidrogênio.

“Nos últimos anos, o peróxido de hidrogênio tem deixado de ser visto apenas como um vilão, que serve para oxidar proteínas, DNA e causar dano celular. Estudos recentes têm mostrado que ele também atua como agente sinalizador e, para isso, precisa haver interação com peroxirredoxinas”, contou o pesquisador.

Como explicou Netto, alguns tipos de câncer e de doenças neurodegenerativas podem estar ligados a falhas nessa sinalização mediada pelo peróxido de hidrogênio. “As peroxirredoxinas, ao modular o nível de peróxido nas células, atuam indiretamente na manutenção da homeostase celular redox, cuja desregulação está envolvida em diversas doenças de caráter genético ou infeccioso”, explicou.
Esse estudo fez parte da tese de doutorado de Carlos Abrunhosa Tairum Junior, na Unesp, com apoio da FAPESP.

No trabalho publicado na Scientific Reports, os pesquisadores mostraram o papel catalítico-estrutural de aminoácidos Treonina/Serina, que são completamente conservados em todas as peroxirredoxinas. “Esses aminoácidos modulam grandes alterações estruturais em peroxirredoxinas, com repercussões na atividade catalítica”, disse Netto.

O artigo “Catalytic Thr or Ser Residue Modulates Structural Switches in 2-Cys Peroxiredoxin by Distinct Mechanisms” pode ser lido em: http://www.nature.com/articles/srep33133.

Já o artigo “Ohr plays a central role in bacterial responses against fatty acid hydroperoxides and peroxynitrite” pode ser acessado pelo endereço: http://www.pnas.org/content/114/2/E132.

Como as bactérias se defendem de oxidantes 

 

Pesquisadores identificaram substratos biológicos de enzima bacteriana

 

[25/01/2017]

Pesquisa realizada pelo CEPID REDOXOMA, financiado pela FAPESP (http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/58576/redoxoma/) revelou novos aspectos relacionados ao mecanismo de ação da enzima chamada Ohr (proteína de resistência a hidroperóxidos orgânicos, na sigla em inglês), que confere a diversas espécies de bactérias a capacidade de neutralizar substâncias oxidantes liberadas pelo sistema de defesa do organismo hospedeiro – seja ele planta ou animal.

A pesquisa contou com pesquisadores do Brasil e do exterior, dentre eles o Prof. Marcos A. de Oliveira do Instituto de Biociências da Unesp- Câmpus do Litoral Paulista, e os resultados foram divulgados recentemente na revista Proceedings of the National Academy of Sciences (http://www.pnas.org/content/114/2/E132) . Segundo os autores, o conhecimento pode abrir caminho para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para doenças causadas por microrganismos em plantas e animais.

De acordo com Luis Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo: “Não há em plantas ou em animais nenhuma proteína conhecida com estrutura semelhante à da Ohr. Isso sugere que é possível inibir essa enzima na bactéria sem causar grandes prejuízos ao organismo infectado e, por isso, ela se torna um alvo interessante para o desenvolvimento de fármacos”, afirmou o professor do Instituto de Biociências (IB-USP) Luis Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo. Ressaltando que ainda faltam dados que liguem Ohr a virulência/patogenicidade de bactérias.

“Quando começamos a investigação, já sabíamos que a Ohr tinha função antioxidante, mas não eram conhecidos os substratos fisiológicos dessa enzima. Nós mostramos neste estudo que ela neutraliza preferencialmente peróxidos – particularmente os hidroperóxidos de ácidos graxos de cadeia longa e o peroxinitrito”, disse Netto.

Segundo Marcos A. de Oliveira,  da Unesp - CLP: “Determinamos a estrutura em nível atômico desta proteína o que forneceu subsídios para que pudéssemos entender um pouco mais de seu funcionamento e de moléculas envolvidas na resistência desta bactéria nos hospedeiros. De fato, a estrutura da proteína revelou uma molécula no sitio ativo de Ohr (local utilizado para detoxificar substancias danosas a bactéria) o que nos deu uma ideia de substratos biológicos.”

Em seguida  autores do trabalho fizeram os chamados testes de ancoragem molecular (“docking”)–  por simulação computacional que mostra o encaixe dos possíveis substratos ao sítio ativo da enzima. Essas análises mostraram grande complementariedade estrutural entre a Ohr e diferentes tipos de hidroperóxidos de ácidos graxos, como os derivados do ácido araquidônico e do ácido linoleico, substâncias que atuam como mediadores de processos inflamatórios em mamíferos e em plantas, respectivamente.


A esquerda está representada a estrutura da proteína Ohr determinada pelo grupo de pesquisa em que foi encontrada um ligante (polietileno glicol) no sitio ativo da enzima (representado em verde, branco e vermelho). A direita é mostrada o resultado de ancoragem molecular onde os hidroperóxidos se ligam especificamente ao sitio ativo da enzima. 

Para validar estas descobertas, foram feitos ensaios in vitro com a proteína Ohr produzida pela Xylella fastidiosa bactéria causadora da doença clorose variegada dos citros (CVC) ou “amarelinho”, que ataca a laranja. Conforme explicou Netto, o trabalho é um desdobramento do projeto genoma (http://www.bv.fapesp.br/linha-do-tempo/1206/genoma-xylella/) realizado nos anos 1990, com apoio da FAPESP, para sequenciar o genoma da X. fastidiosa.

Nos testes in vitro, os cientistas  incubaram a Ohr purificada com diversos tipos de hidroperóxidos. O objetivo foi medir o tempo necessário para a enzima transformar cada um desses oxidantes em substâncias menos tóxicas.  “Observamos, por exemplo, que ela consegue neutralizar o peróxido de hidrogênio [água oxigenada], mas o processo é 100 mil vezes mais lento do que no caso do hidroperóxido de ácido araquidônico”, contou Netto.

Uma surpresa para o grupo nessa etapa foi observar que, em contato com o peroxinitrito, a enzima agia com a mesma eficiência observada com os hidroperóxidos de  ácido araquidônico e o ácido linoleico – algo não previsto nas simulações computacionais.

 “O peroxinitrito é um produto formado por dois outros radicais: o superóxido e o óxido nítrico. É liberado tanto por plantas quanto mamíferos em resposta à infecção por patógenos”, explicou o pesquisador.

O passo seguinte foi a realização de ensaios microbiológicos e, para isso, o grupo do  IB-USP usou com linhagens de bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa, que em humanos é responsável por causar infecções oportunistas, no trato respiratório, urinário e ouvido no homem.

 “Comparamos um grupo de bactérias mutantes, que tiveram o gene da Ohr  deletado, com bactérias selvagens [capazes de produzir a enzima]. Os dois grupos foram colocados em diferentes concentrações de hidroperóxidos para testar sua resistência”, contou Netto. Enquanto as bactérias selvagens conseguiam crescer mesmo em altas concentração de hidroperóxidos, as linhagens mutantes paravam de se multiplicar mesmo nas doses mais baixas. Porém, quando o gene da Ohr foi  inserido na linhagem  mutante, essas bactérias voltaram a mostrar resistência aos oxidantes comparável as células selvagens.

Os testes feitos na USP mostraram que outras bactérias mutantes sem essas outras enzimas antioxidantes não apresentaram a mesma sensibilidade aos hidroperóxidos de ácidos graxos e ao peroxinitrito que a observada na linhagem mutante sem Ohr. Na avaliação dos pesquisadores, esse dado sugere que a Ohr tem papel central na defesa antioxidante bacteriana.

Segundo os pesquisadores: “Estes resultados são bastante importantes, pois dentre os organismos que possuem esta proteína estão diversos patógenos a família Xanthomonadaceae responsáveis por doenças infeciosas em culturas de plantas de importância econômica e social como alfafa, algodão, amêndoa, arroz, café, laranja, pêssego, pêra, uva, entre outras, como também em animais e humanos também como Actinobacillus pleuropneumoniae (pneumonia em suínos), Francisella tularensis (tularemia em humanos), Mycoplasma genitalium (infeções no trato genital e urinário em humanos).

Neste contexto, o entendimento do funcionamento e dos substratos da enzima pode levar a descoberta de novos quimioterápicos para auxiliar no tratamento de doenças em que os patógenos possuem a proteína Ohr”.

Além dos pesquisadores mencionados também participaram do trabalho Thiago Alegria, autor principal, José Renato Cussiol e Diogo Meireles, todos com projetos de pós-graduação  orientados pelo Prof. Netto e vinculados ao Centro de Pesquisa em Processos Redox em Biomedicina (Redoxoma); os pesquisadores do Instituto de Quimica da USP- SP Paolo Di Mascio, Sayuri Miyamoto, Raphael F. Queiroz e Ohara Augusto (coordenadora do CEPID Redoxoma); Napolea?o Fonseca Valadares e Richard C. Garratt do Instituto de Física da USP São Carlos; Rafael Radi, Martín Hugo, Madia Trujillo da Universidad de la Repu?blica do Uruguai (UDELAR).

Contato do pesquisador

Marcos Antonio de Oliveira
Lab. Biologia Molecular Estrutural
Instituto de Biociências

Unesp - Câmpus do Litoral Paulista

TEL: 13-3569 7120 e 3569 7148
mao@clp.unesp.br e scaffix@gmail.com

Estudo comprova atividades antioxidante e antimicrobiana da própolis orgânica brasileira

08/07/2014

Por José Tadeu Arantes
Agência FAPESP – O Brasil é o segundo maior produtor mundial de própolis, sendo superado apenas pela China. Das 700 a 800 toneladas de própolis consumidas anualmente no mundo, o país responde por 150 a 170 toneladas, atendendo, entre outros clientes, a 80% da demanda do mercado japonês. No entanto, o número de patentes brasileiras em relação ao produto é, ainda, extremamente baixo. Estima-se que mais de 43% das patentes mundiais com própolis brasileiras tenham sido depositadas por instituições ou empresas do Japão.

Pesquisa investigou 78 amostras, coletadas em diferentes apiários no sul do Paraná e norte de Santa Catarina (foto: Wikimedia)

Há, atualmente, um forte interesse do mercado europeu pela própolis orgânica certificada produzida no Brasil, porque o produto estaria isento de metais pesados e contaminantes microbianos, bem como pela peculiaridade de seu sabor suave. Mas não havia, até recentemente, nenhum estudo atestando que essa própolis fosse capaz de atender às expectativas dos consumidores, que buscam o produto por suas possíveis propriedades antioxidantes, antimicrobianas, anti-inflamatórias, anticariogênicas e até mesmo anticancerígenas.
Um estudo que confirmou as propriedades antioxidantes e antimicrobianas da própolis orgânica certificada produzida na Região Sul do Brasil foi finalizado recentemente pelo engenheiro agrônomo Severino Matias de Alencar, professor associado da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq), da Universidade de São Paulo (USP), com apoio da FAPESP.

Em colaboração com o farmacêutico Pedro Luiz Rosalen, professor titular de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP), da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), e com a participação da doutoranda Ana Paula Tiveron (Esalq) e do pós-doutorando Bruno Bueno Silva (Instituto de Ciências Biomédicas, USP), ambos bolsistas da FAPESP, Alencar investigou 78 amostras, coletadas no sul do Paraná e norte de Santa Catarina, em diferentes apiários.

Nesse total, identificou sete variantes de própolis orgânica, com comprovadas atividades antioxidante (avaliada pelos métodos de sequestro do radical superóxido, do radical peroxila e do ácido hipocloroso) e antimicrobiana (em relação às bactérias Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Staphylococcus aureus, Streptococcus oralis e Pseudomonas aeruginosa).

“Foi uma constatação importante porque havia dúvida em relação a essas própolis orgânicas, por causa dos teores muito baixos de flavonoides, que são as substâncias notoriamente responsáveis pelas propriedades antioxidantes e antimicrobianas das própolis, principalmente de clima temperado. Porém, verificamos que essas mesmas propriedades são exercidas, com igual eficácia, pelos ácidos fenólicos”, disse Alencar à Agência FAPESP. “Constatamos, nas variedades pesquisadas, altos teores de ácidos gálico, cafeico e cumárico, entre outros tipos de ácidos fenólicos.”
Os ácidos fenólicos e os flavonoides pertencem à mesma classe química dos compostos fenólicos, cuja principal característica é a presença em suas moléculas de pelo menos um radical hidroxila ligado a um anel benzênico.

“A atividade antioxidante decorre da doação de elétrons ou íons de hidrogênio (H+), originários da hidroxila, que reduzem os radicais livres oxidantes. Já a atividade antimicrobiana decorre de um entre os três modos de ação seguintes: (1) reação com a membrana celular, alterando sua permeabilidade e causando perda de constituintes celulares ou mudanças conformacionais em ácidos graxos dessa membrana; (2) inativação de sistemas enzimáticos ou de enzimas essenciais, como a H+ATPase; ou (3) suprarregulação ou infrarregulação, envolvendo genes de adaptação ao estresse, glicólises e outros fatores”, explicaram Alencar e Rosalen.
Atividade protetora
A atividade antimicrobiana da própolis já era empiricamente conhecida pelos antigos sacerdotes egípcios, que a utilizavam no processo de embalsamamento, para proteger as múmias do ataque de fungos e bactérias. Há relatos de uso da própolis também na Idade Média, para prevenir infecções no cordão umbilical de recém-nascidos. E, até mesmo na Segunda Guerra Mundial, a própolis foi empregada como agente cicatrizante e antimicrobiano no tratamento de soldados em alguns hospitais da antiga União Soviética.
O produto consiste, basicamente, em uma resina vegetal, exsudada por plantas, e coletada em botões florais pelas abelhas presentes no bioma. As abelhas recolhem a resina e a carregam para a colmeia, onde ela desempenha várias funções úteis, como as de vedação, impermeabilização e assepsia ambiental, entre outras. Foram essas funções, essenciais para a preservação da colmeia, que fizeram com que o material fosse chamado de “própolis” (do grego, pro, “em benefício de”, e polis, “cidade”).
“Muitas plantas secretam resinas para proteger os brotos e as folhas em crescimento. Por causa de sua constituição, rica em compostos fenólicos, essas resinas têm um grande poder antioxidante, antifúngico e antibacteriano. As abelhas raspam as plantas e transportam as resinas”, detalhou Alencar.
“Uma vez na colmeia, a função da própolis é, antes de tudo, de proteção física, pois as abelhas têm fobia à luz e utilizam a resina para vedar as frestas e criar um ambiente penumbroso e termicamente isolado. Em razão de sua ação antimicrobiana, o material funciona também como um poderoso esterilizador, fazendo com que a atmosfera interna da colmeia seja muito mais estéril do que a atmosfera externa.”

Os produtores retiram a própolis, abrindo janelas laterais, de dois a três centímetros de altura, na cobertura resinosa da colmeia – janelas que as abelhas voltam a fechar, com mais resina.
“As amostras que colhemos foram produzidas em áreas de mata nativa ou de reflorestamento. E isso confere à produção da própolis orgânica uma virtude a mais, que é a de estimular a preservação ambiental, indispensável ao êxito do empreendimento”, afirmou o pesquisador.
“A doutoranda Ana Paulo Tiveron está pesquisando, por meio das técnic
as de HPLC semipreparativo e espectrometria de massas, os compostos bioativos responsáveis pela atividade antioxidante. Esperamos que, com a identificação desses compostos biologicamente ativos, possamos ter marcadores químicos para essas própolis”, disse.

“Estamos com os trabalhos bastante adiantados para, muito em breve, depositar patentes associadas à própolis orgânica, garantindo a propriedade intelectual ao país”, acrescentou.
O passo seguinte, já planejado por Alencar e Rosalen, será o estudo da possível atividade anti-inflamatória e antinociceptiva (analgésica) e da citotoxicidade e da ação antiproliferativa (anticancerígena) da própolis orgânica.

Além disso, os pesquisadores pretendem investigar as eventuais diferenças entre as soluções aquosa e alcoólica de própolis. A pesquisa que conduziram até agora foi feita com a solução alcoólica, que é a mais fácil de produzir. Porém, como muitos consumidores não podem ou não querem ingerir álcool, existe uma demanda crescente pelo extrato aquoso. “A empresa que industrializa o produto na região de União da Vitória, no Paraná, está muito interessada em atender esse segmento do mercado e nos solicitou um estudo a respeito”, afirmou Alencar.