Descrição do mecanismo pode tornar mais eficiente a terapia fotodinâmica, usada no tratamento de câncer e de infecções bacterianas, além de permitir o desenvolvimento de protetores solares mais eficientes (imagem: divulgação)

Cientistas descobrem como a luz destrói membrana das células

04 de janeiro de 2019

André Julião  |  Agência FAPESP – A incidência de luz tem papel fundamental na alteração das células humanas. Um exemplo conhecido é a luz do Sol, que provoca desde o envelhecimento até o câncer de pele. Como isso ocorre, porém, ainda é algo pouco conhecido. 

Mas agora pesquisadores conseguiram descrever, de maneira inédita, o mecanismo pelo qual a luz destrói as membranas lipídicas – que pode levar à morte das células. As futuras aplicações para a descoberta podem ser versões mais eficientes da chamada terapia fotodinâmica, usada contra alguns tipos de câncer e infecções bacterianas. Além disso, o conhecimento do mecanismo abre caminho para o desenvolvimento de protetores solares mais eficientes.  

Por ora, os pesquisadores conseguiram definir parâmetros para criar moléculas que sejam mais eficientes em danificar membranas, tornando as células mais suscetíveis à terapia fotodinâmica – em que a luz é usada para matar células cancerosas ou bactérias. 

O trabalho, publicado no Journal of the American Chemical Society, é resultado do doutorado de Isabel Bacellar no Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP), no âmbito do Centro de Pesquisa em Processos Redox em Biomedicina (Redoxoma), um dos Centros de Pesquisa, Inovação e Difusão (CEPIDs) financiados pela FAPESP.

Parte do estudo foi realizado com bolsa de pesquisa no exterior.

“Mostramos que na hora de escolher um fotossensibilizador [substância que possibilita a conversão da energia da luz em dano à membrana celular] não adianta apenas olhar para o quanto ele gera de oxigênio singlete [espécie reativa de oxigênio], como tem sido feito até hoje”, disse Bacellar, atualmente fazendo pós-doutorado na Universidade de Montreal, no Canadá.

“O oxigênio singlete é importante, mas no processo de dano em membrana descobrimos que o fundamental é o quanto o fotossensibilizador gera de aldeídos lipídicos [substâncias que abrem poros nas membranas e levam ao vazamento do conteúdo da célula ou de suas organelas]”, disse. 

“Quando se entende o mecanismo do dano na membrana, pode-se tanto desenvolver uma molécula mais eficiente para destruir a membrana de organelas, no caso de câncer ou de uma infecção bacteriana, quanto prevenir o dano que ocorre quando nos expomos à luz solar”, disse Mauricio da Silva Baptista, professor do IQ-USP e coordenador do estudo.

Da manteiga à pele

Todas as células são envolvidas por uma membrana formada por uma camada dupla de lipídios que separa o interior do exterior. Os chamados fosfolipídios formam a base estrutural dessa camada e tendem a sofrer oxidações, que podem tornar as membranas permeáveis e provocar a morte celular. A indução dessas oxidações por luz pode aumentar expressivamente a extensão do dano aos lipídios.

“A oxidação lipídica ocorre mesmo no escuro, mas é maior quando tem luz. Como acontece com a manteiga, que tem lipídios e fica rançosa se ficar fora da geladeira por muito tempo. Isso é uma oxidação lipídica também”, disse Baptista.

Para chegar aos resultados, os pesquisadores utilizaram um modelo experimental em que aplicavam dois fotossensibilizadores em uma membrana artificial feita com substâncias presentes na membrana das células. Os fotossensibilizadores foram o azul de metileno e o DO15.  

O DO15 mostrou um desempenho melhor, tornando as membranas mais permeáveis significativamente mais rápido do que o azul de metileno. Em seguida, os pesquisadores identificaram e quantificaram todos os produtos gerados da reação das membranas com os fotossensibilizadores, como hidroperóxidos, álcoois, cetonas e aldeídos fosfolipídicos.

O objetivo era entender o mecanismo pelo qual o DO15 foi mais eficiente em permeabilizar as membranas. O que se mostrou mais importante no processo foi um aumento significativo na produção de aldeídos.

“O oxigênio singlete, que era visto até então como o agente mais importante nesse processo, e o hidroperóxido têm sim uma importância. Mas o que mostramos nesse trabalho é que a produção de aldeído é o principal fator para destruir a membrana lipídica”, disse Bacellar. 

Agora, o grupo de Baptista e outros que colaboram com ele buscam desenvolver moléculas ainda mais eficientes que o DO15 para tornar a membrana das células mais suscetível à luz. Com isso, podem chegar a novos fotossensibilizadores para a terapia fotodinâmica. 

O artigo Photosensitized Membrane Permeabilization Requires Contact-Dependent Reactions between Photosensitizer and Lipids (doi: 10.1021/jacs.8b05014), de Isabel O. L. Bacellar, Maria Cecilia Oliveira, Lucas S. Dantas, Elierge B. Costa, Helena C. Junqueira, Waleska K. Martins, Andrés M. Durantini, Gonzalo Cosa, Paolo Di Mascio, Mark Wainwright, Ronei Miotto, Rodrigo M. Cordeiro, Sayuri Miyamoto e Mauricio S. Baptista, está disponível em: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.8b05014. 

Enzima ajuda bactérias a se defenderem de oxidantes gerados pelo sistema imune

03 de fevereiro de 2017

Karina Toledo  |  Agência FAPESP – Uma pesquisa apoiada pela FAPESP e conduzida na Universidade de São Paulo (USP) em colaboração com outras instituições de pesquisa nacionais e internacionais, revelou novos aspectos relacionados ao mecanismo de ação da enzima Ohr (proteína de resistência a hidroperóxidos orgânicos, na sigla em inglês), que confere a diversas espécies de bactérias a capacidade de neutralizar substâncias oxidantes liberadas pelo sistema de defesa do organismo hospedeiro – seja ele planta ou animal.

Em pesquisa publicada na PNAS, pesquisadores do Cepid Redoxoma identificaram substratos biológicos da enzima bacteriana Ohr, um potencial alvo para o desenvolvimento de novos fármacos (Figura: Docking molecular de hidroperóxidos de cadeia longa no sítio ativo da Ohr/Thiago G. P. Alegria, et al.)

Os resultados foram divulgados recentemente na revista Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS). Segundo os autores, o conhecimento pode possibilitar novas abordagens terapêuticas.

“Não há em plantas ou em animais nenhuma proteína conhecida com estrutura semelhante à da Ohr. Isso sugere que é possível inibir essa enzima na bactéria sem causar grandes prejuízos ao organismo infectado e, por isso, ela se torna um alvo interessante para o desenvolvimento de fármacos”, afirmou o professor do Instituto de Biociências (IB-USP) Luis Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo.
O pesquisador ressaltou, no entanto, que ainda faltam dados que relacionem a presença da Ohr com a virulência dos patógenos.

Diversos experimentos foram feitos pela equipe de Netto para entender como a Ohr participa da defesa antioxidante de bactérias, muitas delas patogênicas. Parte da investigação foi conduzida durante o mestrado de Thiago Alegria, o doutorado de José Renato Cussiol e o pós-doutorado de Diogo Meireles – todos bolsistas da FAPESP. Os projetos estão vinculados ao Centro de Pesquisa em Processos Redox em Biomedicina (Redoxoma), um dos Centros de Pesquisa, Inovação e Difusão (CEPIDs) apoiados pela Fundação.

“Quando começamos a pesquisa, já sabíamos que a Ohr tinha função antioxidante, mas não eram conhecidos os substratos fisiológicos dessa enzima. Nós mostramos neste estudo que ela neutraliza preferencialmente peróxidos – particularmente os hidroperóxidos de ácidos graxos de cadeia longa – e o peroxinitrito”, contou Netto.

Para chegar a essa conclusão, os pesquisadores fizeram inicialmente os chamados testes de ancoragem molecular (docking). Por simulação computacional foi possível ver o encaixe dos possíveis substratos ao sítio ativo da enzima. Essas análises mostraram grande complementariedade estrutural entre a Ohr e diferentes tipos de hidroperóxidos de ácidos graxos, como os derivados do ácido araquidônico e do ácido linoleico, substâncias que atuam como mediadores de processos inflamatórios em mamíferos e em plantas, respectivamente.

Para validar esse primeiro achado, foram feitos ensaios bioquímicos in vitro com a proteína Ohr produzida pela Xylella fastidiosa – bactéria causadora da doença clorose variegada dos citros (CVC) ou “amarelinho”, que ataca os citros. Conforme explicou Netto, o trabalho é um desdobramento do projeto realizado nos anos 1990, com apoio da FAPESP, para sequenciar o genoma da X. fastidiosa.
Nos testes in vitro, os cientistas incubaram a Ohr purificada com diversos tipos de hidroperóxidos. O objetivo foi medir o tempo necessário para a enzima transformar cada um desses oxidantes em substâncias menos tóxicas.

“Observamos, por exemplo, que ela consegue neutralizar o peróxido de hidrogênio [água oxigenada], mas o processo é 100 mil vezes mais lento do que no caso do hidroperóxido de ácido araquidônico”, contou Netto.

Segundo o pesquisador, a reação química ocorreu na escala de milissegundos quando a enzima foi incubada com os hidroperóxidos de ácidos graxos. Já com outros tipos de hidroperóxidos o processo ocorreu na escala de minutos.

Uma surpresa para o grupo nessa etapa foi observar que, em contato com o peroxinitrito, a enzima agia com a mesma eficiência observada com os hidroperóxidos de ácido araquidônico e o ácido linoleico – algo não previsto nas simulações computacionais.
“O peroxinitrito é um produto formado por dois outros radicais: o superóxido e o óxido nítrico. É liberado tanto por plantas quanto mamíferos em resposta à infecção por patógenos”, explicou o pesquisador.

Inibição do crescimento

O passo seguinte foi a realização de ensaios microbiológicos e, para isso, o grupo do IB-USP usou linhagens de bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa, que em humanos costuma causar infecções oportunistas, por exemplo, no sistema respiratório.

“Comparamos um grupo de bactérias mutantes, que tiveram o gene da Ohr deletado, com bactérias selvagens [capazes de produzir a enzima]. Os dois grupos foram colocados em diferentes concentrações de hidroperóxidos para testar sua resistência”, contou Netto.

Enquanto as bactérias selvagens conseguiam crescer mesmo em altas concentrações de hidroperóxidos, as linhagens mutantes paravam de se multiplicar mesmo nas doses mais baixas. Porém, quando o gene da Ohr foi inserido novamente na linhagem mutante, essas bactérias voltaram a mostrar resistência aos oxidantes em nível comparável ao das células selvagens.
Conforme explicou Netto, ao longo do processo evolutivo, as bactérias desenvolveram um grande repertório de proteínas antioxidantes para lidar com as defesas dos organismos hospedeiros – entre elas destacam-se as enzimas peroxirredoxinas e catalases.

Os testes feitos na USP mostraram que outras bactérias mutantes, com a deleção dessas outras enzimas antioxidantes, não apresentaram a mesma sensibilidade aos hidroperóxidos de ácidos graxos e ao peroxinitrito que a observada na linhagem mutante sem Ohr. Na avaliação de Netto, esse dado sugere que a Ohr tem papel central na defesa antioxidante bacteriana.

Peroxirredoxina

Em outro trabalho, publicado na revista Scientific Reports, o grupo de Netto em colaboração com o grupo do professor Marcos Antonio de Oliveira, da Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus Experimental do Litoral Paulista, estudou outra enzima antioxidante: a peroxirredoxina.
Essas proteínas são capazes de neutralizar muito rapidamente o peróxido de hidrogênio. Por serem muito abundantes e reativas, disse Netto, são consideradas os sensores celulares de peróxido de hidrogênio.

“Nos últimos anos, o peróxido de hidrogênio tem deixado de ser visto apenas como um vilão, que serve para oxidar proteínas, DNA e causar dano celular. Estudos recentes têm mostrado que ele também atua como agente sinalizador e, para isso, precisa haver interação com peroxirredoxinas”, contou o pesquisador.

Como explicou Netto, alguns tipos de câncer e de doenças neurodegenerativas podem estar ligados a falhas nessa sinalização mediada pelo peróxido de hidrogênio. “As peroxirredoxinas, ao modular o nível de peróxido nas células, atuam indiretamente na manutenção da homeostase celular redox, cuja desregulação está envolvida em diversas doenças de caráter genético ou infeccioso”, explicou.
Esse estudo fez parte da tese de doutorado de Carlos Abrunhosa Tairum Junior, na Unesp, com apoio da FAPESP.

No trabalho publicado na Scientific Reports, os pesquisadores mostraram o papel catalítico-estrutural de aminoácidos Treonina/Serina, que são completamente conservados em todas as peroxirredoxinas. “Esses aminoácidos modulam grandes alterações estruturais em peroxirredoxinas, com repercussões na atividade catalítica”, disse Netto.

O artigo “Catalytic Thr or Ser Residue Modulates Structural Switches in 2-Cys Peroxiredoxin by Distinct Mechanisms” pode ser lido em: http://www.nature.com/articles/srep33133.

Já o artigo “Ohr plays a central role in bacterial responses against fatty acid hydroperoxides and peroxynitrite” pode ser acessado pelo endereço: http://www.pnas.org/content/114/2/E132.