Enzima ajuda bactérias a se defenderem de oxidantes gerados pelo sistema imune
03 de fevereiro de 2017
Karina Toledo |
Agência FAPESP – Uma pesquisa
apoiada pela FAPESP
e conduzida na Universidade de São Paulo (USP) em colaboração com
outras instituições de pesquisa nacionais e internacionais, revelou
novos aspectos relacionados ao mecanismo de ação da enzima Ohr (proteína
de resistência a hidroperóxidos orgânicos, na sigla em inglês), que
confere a diversas espécies de bactérias a capacidade de neutralizar
substâncias oxidantes liberadas pelo sistema de defesa do organismo
hospedeiro – seja ele planta ou animal.
Em pesquisa publicada na PNAS,
pesquisadores do Cepid Redoxoma identificaram substratos biológicos da
enzima bacteriana Ohr, um potencial alvo para o desenvolvimento de novos
fármacos (Figura: Docking molecular de hidroperóxidos de cadeia longa no sítio ativo da Ohr/Thiago G. P. Alegria, et al.)
Os resultados foram
divulgados recentemente na revista
Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS). Segundo os autores, o conhecimento pode possibilitar novas abordagens terapêuticas.
“Não há em plantas ou em animais nenhuma proteína conhecida com
estrutura semelhante à da Ohr. Isso sugere que é possível inibir essa
enzima na bactéria sem causar grandes prejuízos ao organismo infectado
e, por isso, ela se torna um alvo interessante para o desenvolvimento de
fármacos”, afirmou o professor do Instituto de Biociências (IB-USP)
Luis Eduardo Soares Netto, coordenador do estudo.
O pesquisador ressaltou, no entanto, que ainda faltam dados que relacionem a presença da Ohr com a virulência dos patógenos.
Diversos experimentos foram feitos pela equipe de Netto para entender
como a Ohr participa da defesa antioxidante de bactérias, muitas delas
patogênicas. Parte da investigação foi conduzida durante o
mestrado de Thiago Alegria, o
doutorado de José Renato Cussiol e o
pós-doutorado de
Diogo Meireles – todos bolsistas da FAPESP. Os projetos estão
vinculados ao Centro de Pesquisa em Processos Redox em Biomedicina (
Redoxoma), um dos Centros de Pesquisa, Inovação e Difusão (
CEPIDs) apoiados pela Fundação.
“Quando começamos a pesquisa, já sabíamos que a Ohr tinha função
antioxidante, mas não eram conhecidos os substratos fisiológicos dessa
enzima. Nós mostramos neste estudo que ela neutraliza preferencialmente
peróxidos – particularmente os hidroperóxidos de ácidos graxos de cadeia
longa – e o peroxinitrito”, contou Netto.
Para chegar a essa conclusão, os pesquisadores fizeram inicialmente os chamados testes de ancoragem molecular (
docking).
Por simulação computacional foi possível ver o encaixe dos possíveis
substratos ao sítio ativo da enzima. Essas análises mostraram grande
complementariedade estrutural entre a Ohr e diferentes tipos de
hidroperóxidos de ácidos graxos, como os derivados do ácido araquidônico
e do ácido linoleico, substâncias que atuam como mediadores de
processos inflamatórios em mamíferos e em plantas, respectivamente.
Para validar esse primeiro achado, foram feitos ensaios bioquímicos
in vitro com a proteína Ohr produzida pela
Xylella fastidiosa
– bactéria causadora da doença
clorose variegada dos citros (CVC) ou
“amarelinho”, que ataca os citros. Conforme explicou Netto, o trabalho é
um desdobramento do
projeto realizado nos anos 1990, com apoio da FAPESP, para sequenciar o genoma da
X. fastidiosa.
Nos testes
in vitro, os cientistas incubaram a Ohr purificada
com diversos tipos de hidroperóxidos. O objetivo foi medir o tempo
necessário para a enzima transformar cada um desses oxidantes em
substâncias menos tóxicas.
“Observamos, por exemplo, que ela consegue neutralizar o peróxido de
hidrogênio [água oxigenada], mas o processo é 100 mil vezes mais lento
do que no caso do hidroperóxido de
ácido araquidônico”, contou Netto.
Segundo o pesquisador, a reação química ocorreu na escala de
milissegundos quando a enzima foi incubada com os hidroperóxidos de
ácidos graxos. Já com outros tipos de hidroperóxidos o processo ocorreu
na escala de minutos.
Uma surpresa para o grupo nessa etapa foi observar que, em contato
com o peroxinitrito, a enzima agia com a mesma eficiência observada com
os hidroperóxidos de ácido araquidônico e o ácido linoleico – algo não
previsto nas simulações computacionais.
“O peroxinitrito é um produto formado por dois outros radicais: o
superóxido e o óxido nítrico. É liberado tanto por plantas quanto
mamíferos em resposta à infecção por patógenos”, explicou o pesquisador.
Inibição do crescimento
O passo seguinte foi a realização de ensaios microbiológicos e, para
isso, o grupo do IB-USP usou linhagens de bactérias da espécie
Pseudomonas aeruginosa, que em humanos costuma causar infecções oportunistas, por exemplo, no sistema respiratório.
“Comparamos um grupo de bactérias mutantes, que tiveram o gene da Ohr
deletado, com bactérias selvagens [capazes de produzir a enzima]. Os
dois grupos foram colocados em diferentes concentrações de
hidroperóxidos para testar sua resistência”, contou Netto.
Enquanto as bactérias selvagens conseguiam crescer mesmo em altas
concentrações de
hidroperóxidos, as linhagens mutantes paravam de se
multiplicar mesmo nas doses mais baixas. Porém, quando o gene da Ohr foi
inserido novamente na linhagem mutante, essas bactérias voltaram a
mostrar resistência aos oxidantes em nível comparável ao das células
selvagens.
Conforme explicou Netto, ao longo do processo evolutivo, as bactérias
desenvolveram um grande repertório de proteínas antioxidantes para
lidar com as defesas dos organismos hospedeiros – entre elas destacam-se
as enzimas peroxirredoxinas e catalases.
Os testes feitos na USP mostraram que outras bactérias mutantes, com a
deleção dessas outras enzimas antioxidantes, não apresentaram a mesma
sensibilidade aos hidroperóxidos de ácidos graxos e ao peroxinitrito que
a observada na linhagem mutante sem Ohr. Na avaliação de Netto, esse
dado sugere que a Ohr tem papel central na defesa antioxidante
bacteriana.
Peroxirredoxina
Em outro trabalho,
publicado na revista
Scientific Reports,
o grupo de Netto em colaboração com o grupo do professor Marcos Antonio
de Oliveira, da Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus
Experimental do Litoral Paulista, estudou outra enzima antioxidante: a
peroxirredoxina.
Essas proteínas são capazes de neutralizar muito rapidamente o
peróxido de hidrogênio. Por serem muito abundantes e reativas, disse
Netto, são consideradas os sensores celulares de
peróxido de hidrogênio.
“Nos últimos anos, o peróxido de hidrogênio tem deixado de ser visto
apenas como um vilão, que serve para oxidar proteínas, DNA e causar dano
celular. Estudos recentes têm mostrado que ele também atua como agente
sinalizador e, para isso, precisa haver interação com peroxirredoxinas”,
contou o pesquisador.
Como explicou Netto, alguns tipos de câncer e de doenças
neurodegenerativas podem estar ligados a falhas nessa sinalização
mediada pelo peróxido de hidrogênio. “As peroxirredoxinas, ao modular o
nível de peróxido nas células, atuam indiretamente na manutenção da
homeostase celular redox, cuja desregulação está envolvida em diversas
doenças de caráter genético ou infeccioso”, explicou.
Esse estudo fez parte da tese de
doutorado de Carlos Abrunhosa Tairum Junior, na Unesp, com apoio da FAPESP.
No trabalho publicado na
Scientific Reports, os pesquisadores
mostraram o papel catalítico-estrutural de aminoácidos Treonina/Serina,
que são completamente conservados em todas as peroxirredoxinas. “Esses
aminoácidos modulam grandes alterações estruturais em peroxirredoxinas,
com repercussões na atividade catalítica”, disse Netto.
O artigo “Catalytic Thr or Ser Residue Modulates Structural Switches
in 2-Cys Peroxiredoxin by Distinct Mechanisms” pode ser lido em:
http://www.nature.com/articles/srep33133.
Já o artigo “Ohr plays a central role in bacterial responses against
fatty acid hydroperoxides and peroxynitrite” pode ser acessado pelo
endereço:
http://www.pnas.org/content/114/2/E132.
