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sexta-feira, 9 de novembro de 2018

Bactéria comum que causa infecção alimentar resiste a diferentes classes de antibióticos que podem ser utilizados para o tratamento da doença, indica estudo genômico. Pesquisa também identificou 39 genes responsáveis pela resistência (imagem: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH)

Salmonella tem resistência a diferentes classes de antibióticos

26 de outubro de 2018

Peter Moon | Agência FAPESP – Entre 2000 e 2015, foram registrados pelo Ministério da Saúde em todo o Brasil 11.524 surtos de doenças transmitidas por alimentos, contabilizando 219.909 doentes e 167 óbitos. O principal agente causador dos surtos de infecções alimentares, diarreia e gastroenterites são as bactérias, sendo as mais frequentes aquelas do gênero Salmonella, com 31,7 mil casos diagnosticados (14,4% do total), seguidas por Staphylococcus aureus (7,4%) e Escherichia coli (6,1%).

Outro levantamento, feito pelo Ministério do Desenvolvimento Social, dá conta de que 42,5% dos surtos alimentares confirmados laboratorialmente no Brasil de 1999 a 2009 tiveram como agente etiológico bactérias do gênero Salmonella.

Na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) da Universidade de São Paulo, um grupo liderado pela professora Juliana Pfrimer Falcão se dedica à investigação genômica das principais bactérias envolvidas nas doenças diarreicas agudas. Em trabalho publicado na revista PLOS ONE, as biomédicas Amanda Aparecida Seribelli e Fernanda Almeida, do grupo de Falcão, sequenciaram e investigaram o genoma de 90 amostras (ou cepas) de uma sorovariedade específica da Salmonella enterica chamada Salmonella Typhimurium (abreviação de Salmonella enterica subespécie 1 serotipo Typhimurium).

As 90 amostras foram isoladas entre 1983 e 2013 no Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto e na Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) do Rio de Janeiro. Elas fornecem um retrato da epidemiologia de salmonelose no Brasil nos últimos 30 anos, pois são provenientes de todas as regiões do país, tendo sido coletadas em pacientes acometidos por infecções alimentares, ou então em alimentos contaminados, como carne aviária e carne suína, incluindo embutidos, ou então vegetais como alface, entre outros.

“De humanos, recebemos amostras de sangue, de abscesso cerebral e fezes diarreicas", disse Seribelli à Agência FAPESP.

Ao testar a ação dos antibióticos em cada uma das 90 cepas, descobriu-se que a grande maioria delas se mostrou resistente a diferentes classes de antibióticos que fazem parte do arsenal da medicina. O estudo também resultou na identificação de 39 genes responsáveis pela resistência aos antibióticos.

Participam do trabalho pesquisadores da Fiocruz, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista (Unesp) e do Instituto Adolfo Lutz. O sequenciamento das 90 cepas de Salmonella Typhimurium foi realizado no Food and Drug Administration (FDA), a agência federal norte-americana responsável pela fiscalização da qualidade de alimentos e medicamentos, durante o doutorado sanduíche de Fernanda Almeida.

A análise comparativa do genoma, do transcriptoma e da caracterização fenotípica de linhagens de Salmonella Typhimurium isoladas de humanos e alimentos no Brasil teve apoio da FAPESP, do FDA e da Capes.

Salmonelose

Salmonella é um gênero extremamente heterogêneo, composto por duas espécies: Salmonella bongori e Salmonella enterica. Esta última é a maior responsável pelos casos de infecção alimentar no Brasil e no mundo. O trato intestinal do homem e dos animais é o principal reservatório natural deste patógeno, sendo os alimentos de origem aviária e suína importantes vias de transmissão.

Existem seis subespécies da bactéria Salmonella enterica, que são por sua vez subdivididas em outras 2,6 mil sorovariedades. Sorovariedades são variantes dentro de uma mesma espécie, que é a caracterização de um microrganismo pela identificação de seus antígenos.

Entre as subespécies de Salmonella enterica, a mais importante do ponto de vista epidemiológico é S. enterica subespécie enterica, causadora da infecção alimentar chamada salmonelose. Os sintomas são diarreia, febre, cólicas abdominais e vômitos.

S. enterica subespécie enterica é a principal responsável pelos 31,7 mil casos de salmonelose identificados no Brasil entre 2000 e 2015. Entre suas diversas sorovariedades, as mais frequentemente isoladas são S. Typhimurium e S. Enteritidis.

S. Enteritidis é uma das principais sorovariedades causadoras de salmonelose e se disseminou a partir de uma pandemia iniciada na Europa nos anos 1990. Já S. Typhimurium era a sorovariedade que prevalecia antes da pandemia, mas que nem por isso deixou de continuar causando infecções.

Almeida conta que todas as 90 amostras analisadas no estudo pertencem às bactérias da sorovariedade S. Typhimurium. No mesmo laboratório de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas da FCFRP, outro pesquisador faz no momento o sequenciamento e análise de amostras da sorovariedade S. Enteritidis.

Com relação à sorovariedade S. Typhimurium, coube a Almeida levar as 90 amostras aos Estados Unidos, em 2015. “Lá, elas tiveram o genoma sequenciado no Centro de Segurança Alimentar e Nutrição Aplicada do FDA, em Maryland, sob a supervisão do pesquisador Marc W. Allard”, disse.

O genoma de S. Typhimurium possui 4,7 milhões de pares de base. Fazendo as contas, percebe-se que o trabalho gerou uma montanha de dados. Mais especificamente 423 milhões de bases, correspondentes à soma dos 90 genomas.

De volta a Ribeirão Preto, Almeida dividiu com Seribelli a tarefa de destrinchar e comparar os genomas das diversas cepas, com vistas a entender sua diversidade e a relação evolutiva que existe entre as diferentes cepas.

Segundo Almeida, a técnica utilizada foi a genotipagem com SNPs (pronuncia-se “snips”, sigla em inglês para “polimorfismos de nucleotídeo único”). Trata-se de um processo para identificar a composição genética (genótipo) de cada cepa, examinando sua sequência de DNA. Os SNPs são um dos tipos mais comuns de marcadores de variação genética. Os resultados filogenéticos separaram as 90 cepas de S. Typhimurium em dois grandes grupos, A e B.

“O grupo das amostras coletadas em alimentos difere daquele grupo de amostras coletadas em pacientes humanos. Isolados alimentares foram distribuídos nos grupos A e B em relativamente números similares, sugerindo que há mais de um subtipo em circulação no Brasil. Isolados de humanos, foram mais prevalentes no grupo B, o que sugere a existência de um subtipo provavelmente mais adaptado entre as cepas isoladas de humanos no país”, disse Seribelli.

Outra parte importante da pesquisa visou aferir o grau de resistência aos antibióticos de cada uma das 90 cepas. De acordo com o trabalho, 65 (72,2%) das 90 cepas de S. Typhimurium se mostraram resistentes aos antibióticos da classe das sulfonamidas, 44 (48,9%) cepas eram resistentes à estreptomicina, 27 (30%) à tetraciclina, 21 (23,3%) à gentamicina e sete (7,8%) eram resistentes às cefalosporinas.

Origem da resistência

O trabalho com SNPs identificou um total de 39 genes de resistência a diferentes classes, como aminoglicosídeos, tetraciclinas, sulfonamidas, trimetoprim, beta-lactâmicos, fluoroquinolonas, fenicol e macrolídeos. Também se constatou a ocorrência de mutações pontuais em alguns dos genes, como gyrA, gyrB, parC e parE.

"Chama a atenção a resistência de S. Typhimurium a antibióticos que podem ser utilizados no tratamento da doença. São drogas que estão à disposição dos médicos para o combate a infecções que apresentam resistência. São a segunda linha de defesa, quando os microrganismos não são mortos pelo sistema imunológico do paciente, uma vez que normalmente a salmonelose é uma doença autolimitada e que não precisa do uso de antibióticos. O maior problema é quando isso falha e a bactéria torna-se invasiva”, disse Seribelli.

Outro ponto que chamou a atenção dos cientistas foram os diferentes graus de resistência das cepas, quando distribuídas ao longo dos 30 anos de coletas.
"As amostras de S. Typhimurium coletadas em meados de 1990 tinham maior resistência aos antibióticos do que aquelas que passaram a circular entre a população após esse período. A possível explicação para isso está na emergência, no início dos anos 90, da sorovariedade S. Enteritidis, que se tornou desde então um dos principais agentes nos casos de salmonelose”, disse Seribelli.
A sorovariedade S. Enteritidis é conhecida desde os anos 1950, porém respondia por uma quantidade menor de casos no conjunto da epidemiologia de Salmonella. Isso mudou radicalmente a partir da mencionada pandemia de S. Enteritidis na Europa na virada dos anos 1980 para os anos 1990, que se espalhou pelo mundo.

"Desde então, S. Enteritidis é uma das sorovariedades mais prevalentes no Brasil e no mundo. Portanto, é uma sorovariedade que também pode ser combatida com o uso de antibióticos caso seja necessário”, disse Seribelli.

Almeida explica que S. Typhimurium ainda permanece sendo uma das principais sorovariedades isoladas de humanos, animais e alimentos no Brasil e no mundo.
A partir da pandemia de S. Enteritidis em meados de 1990 o número de cepas resistentes aparentemente diminuiu em relação às cepas de antes dos anos 90, porém não sabemos se a virulência dessas cepas aumentou para que elas se adaptassem nesse novo nicho.

“O principal resultado do trabalho foi descobrir a grande quantidade de genes de resistência a antimicrobianos encontrados nas amostras, considerando que são amostras isoladas de humanos e alimentos. Constata-se que existe hoje no Brasil um risco muito grande de contaminação a partir dos alimentos com linhagens de Salmonella resistentes a antimicrobianos”, disse Almeida à Agência FAPESP.

O artigo Phylogenetic and antimicrobial resistance gene analysis of Salmonella Typhimurium strains isolated in Brazil by whole genome sequencing (doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201882) de Fernanda Almeida, Amanda Aparecida Seribelli, Marta Inês Cazentini Medeiros, Dália dos Prazeres Rodrigues, Alessandro de Mello Varani, Yan Luo, Marc W. Allard e Juliana Pfrimer Falcão, pode ser lido em http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0201882.

sábado, 20 de outubro de 2018

5 tipos de bactérias que vivem em sua pele

Updated October 10, 2018

Our skin is populated by billions of diverse bacteria. As the skin and outer tissues are in constant contact with the environment, microbes have easy access to colonize these areas of the body. Most of the bacteria that reside on skin and hair are either commensalistic (beneficial to the bacteria but do not help or harm the host) or mutualistic (beneficial to both the bacteria and the host). Some skin bacteria even protect against pathogenic bacteria by secreting substances that prevent harmful microbes from taking up residence. Others protect against pathogens by alerting immune system cells and inducing an immune response.

While most strains of bacteria on the skin are harmless, others can pose serious health problems. These bacteria can cause everything from mild infections (boils, abscesses, and cellulitis) to serious infections of the blood, meningitis, and food poisoning.

Skin bacteria are characterized by the type of environment in which they thrive. There are three main types of skin environments that are populated predominately by three species of bacteria. These environments include the sebaceous or oily areas (head, neck, and trunk), the moist areas (creases of the elbow and between the toes), and the dry areas (broad surfaces of the arms and legs). Propionibacterium are found predominately in the oily areas, Corynebacterium populate the moist areas, and Staphylococcus species typically reside on the dry areas of the skin. The following examples are five common types of bacteria found on the skin from the three categories.

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Propionibacterium acnes

Propionibacterium acnes prosperam nas superfícies oleosas da pele e folículos pilosos. Estas bactérias contribuem para o desenvolvimento da acne, pois elas proliferam devido ao excesso de produção de óleo e poros entupidos. As bactérias Propionibacterium acnes usam o sebo produzido pelas glândulas sebáceas como combustível para o crescimento. O sebo é um lipídio que consiste em gorduras, colesterol e uma mistura de outras substâncias lipídicas. O sebo é necessário para uma boa saúde da pele, uma vez que hidrata e protege os cabelos e a pele. Os níveis anormais de produção de sebo contribuem para a acne, uma vez que obstruem os poros, levam ao crescimento excessivo de bactérias Propionibacterium acnes e induzem uma resposta dos glóbulos brancos que causa inflamação.

Corynebacterium

O gênero Corynebacterium inclui espécies de bactérias patogênicas e não patogênicas. As bactérias Corynebacterium diphteriae produzem toxinas que causam a doença difteria. A difteria é uma infecção que normalmente afeta a garganta e as membranas mucosas do nariz. Também é caracterizada por lesões de pele que se desenvolvem quando as bactérias colonizam a pele previamente danificada. A difteria é uma doença grave e, em casos graves, pode causar danos aos rins, coração e sistema nervoso. Mesmo as corinebactérias não diftéricas foram consideradas patogênicas em indivíduos com sistemas imunológicos suprimidos. Infecções não difterias graves estão associadas a dispositivos de implantes cirúrgicos e podem causar meningite e infecções do trato urinário.

Staphylococcus epidermidis

A bactéria Staphylococcus epidermidis é habitualmente habitantes inofensivos da pele que raramente causam doenças em indivíduos saudáveis. Essas bactérias formam uma barreira espessa de biofilme (uma substância viscosa que protege as bactérias de antibióticos, substâncias químicas e outras substâncias ou condições perigosas) que podem aderir às superfícies dos polímeros. Como tal, S. epidermidis geralmente causam infecções associadas a dispositivos médicos implantados, como cateteres, próteses, marca-passos e válvulas artificiais. S. epidermidis também se tornou uma das principais causas de infecção sanguínea adquirida no hospital e está se tornando cada vez mais resistente aos antibióticos.

Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus is a common type of skin bacterium that may be found in areas such as the skin, nasal cavities, and respiratory tract. While some staph strains are harmless, others such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), can cause serious health issues. S. aureus is typically spread through physical contact and must breach the skin, through a cut, for example, to cause an infection. MRSA is most commonly acquired as a result of hospital stays. S. aureus bacteria are able to adhere to surfaces due to the presence of cell adhesion molecules located just outside of the bacterial cell wall. They can adhere to various types of surfaces, including medical equipment. If these bacteria gain access to internal body systems and cause infection, the consequences can be fatal.

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Streptococcus pyogenes

Streptococcus pyogenes bacteria typically colonize the skin and throat areas of the body. S. pyogenes reside in these areas without causing issues in most cases. However, S. pyogenes can become pathogenic in individuals with compromised immune systems. This species is responsible for a number of diseases that range from mild infections to life-threatening illnesses. Some of these diseases include strep throat, scarlet fever, impetigo, necrotizing fasciitis, toxic shock syndrome, septicemia, and acute rheumatic fever. S. pyogenes produce toxins that destroy body cells, specifically red blood cells and white blood cells. S. pyogenes are more popularly known as "flesh-eating bacteria" because they destroy infected tissue causing what is known as necrotizing fasciitis.

Sources

_{Akst, Jef. "Microbes of the Skin." The
Scientist. Published 13 Jun. 2014
(http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/40228/title/Microbes-of-the-Skin/).}

Antimicrobial (Drug) Resistance. National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Updated 24 Jan. 2014 (http://www.niaid.nih.gov/topics/antimicrobialResistance/Examples/mrsa/Pages/default.aspx).
GAS Frequently Asked Questions. Group A Streptococcal (GAS) Disease. Centers for Disease Control and Prevention. Updated 5 Jan. 2014 (http://www.cdc.gov/groupAstrep/about/faqs.html).
Otto, Michael. "Staphylococcus Epidermidis – the 'accidental' Pathogen." Nature reviews. Microbiology 7.8 (2009): 555–567. PMC. Web. 29 Jan. 2015 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2807625/).
Todar, Kenneth. "The Normal Bacterial Flora of Humans." Online Textbook of Bacteriology. (http://www.textbookofbacteriology.net/normalflora.html).

segunda-feira, 24 de setembro de 2018

A Penicilina e sua origem

A cena se passa em 1928, no hospital Saint Mary’s, em Londres, no bagunçado laboratório do especialista em bacteriologia Alexander Fleming, um simpático senhor escocês de cabelos brancos, olhos azuis, com jeitão de professor Pardal. Durante dias, ele observava uma colônia de Staphylococcus aureus, o temido bacilo que causa infecção generalizada. Numa certa manhã, ao chegar, percebeu que havia deixado a porta do laboratório aberta e, por isso, uma de suas placas de cultivo de micróbios apresentava manchas de bolor esverdeado. O fungo provavelmente entrara pelo corredor, proveniente do andar de baixo (onde funcionava justamente o laboratório de bolores). Fleming tinha esquecido de colocar a bandeja com a cultura do bacilo na incubadora, como de costume – cansado e doido para sair de férias, o professor até pensou em deixar tudo ali mesmo na bancada, onde os bacilos poderiam crescer mais rápido.

Em vez de se chatear com o incidente da pesquisa embolorada, Fleming resolveu tirar proveito dele e observar o que tinha acontecido ali. Percebeu que o fungo Penicillium notatum havia matado as bactérias. A partir dele, extraiu a penicilina. Mas, afinal, o que havia de tão revolucionário nessa substância? Simples: como a penicilina é um bactericida que não é tóxico para o ser humano, pode ser usada para combater infecções sem enfraquecer as defesas do organismo. “Não inventei a penicilina”, dizia Fleming. “A natureza é que a fez. Eu só a descobri por acaso.”

Fleming, aliás, era o rei do acaso. Anos antes, em 1922, ele estudava a proliferação de micróbios em colônias cultivadas a partir de secreções nasais e, sem querer, por estar resfriado, deixou cair uma lágrima sobre a placa. No dia seguinte, notou que o local onde a lágrima havia caído estava isento de micróbios. Foi então que ele descobriu que tecidos e secreções do corpo humano possuem uma substância – a lisoenzima – que tem a capacidade de dissolver certas bactérias.

Depois da descoberta da penicilina, Fleming ficou paranoico atrás de fungos, chegando a virar motivo de piada. Para dar continuidade a sua pesquisa, comprava qualquer objeto mofado que via pela frente, até mesmo galochas e tecido velho de guarda-chuvas, e vivia revirando a casa de amigos atrás de um ou outro pequeno bolor.

Fleming investia o tempo todo em estudos e aplicações do remédio em tecidos infeccionados, lavando os ferimentos na pele com a droga ou aplicando-a em olhos infectados. Suas pesquisas, entretanto, ainda estavam longe de considerar a penicilina administrada em comprimidos ou diretamente na veia do paciente – esta sim viria a ser uma grande revolução na medicina. Na época de Fleming, os médicos eram um tanto resistentes a substâncias que pudessem ser injetadas na veia para afastar infecções.

sábado, 10 de janeiro de 2015

Ação implacável

Pesquisadores descobrem no solo antibiótico natural capaz de matar bactérias resistentes causadoras de doenças graves, como infecções hospitalares e tuberculose.

Por: Sofia Moutinho

Publicado em 09/01/2015 | Atualizado em 09/01/2015

O novo antibiótico se mostrou eficaz contra várias bactérias nocivas à saúde humana e resistentes a outras substâncias, como a 'C. dificile', que provoca diarreias. (foto: Centers for Disease Control and Prevention's Public Health Image Library)

Quase 90 anos depois da descoberta ao acaso da penicilina – primeiro antibiótico a ser usado com sucesso – cientistas anunciam a identificação de um novo antibiótico natural capaz de combater uma série de bactérias causadoras de doenças e resistentes às substâncias disponíveis até então.

O novo antibiótico, batizado de teixobactina, vem do solo, mais especificamente de compostos presentes em bactérias que produzem substâncias protetoras, que matam as bactérias competidoras de seu entorno. A maioria dos antibióticos em uso atualmente foi descoberta desse modo – ao se analisar os microrganismos do solo – mas os bons resultados da técnica pareciam ter ser esgotado desde a década de 1960.

Um dos grandes obstáculos de conseguir isolar antibióticos naturais produzidos por microrganismos do solo é a dificuldade de reproduzir o seu ambiente em laboratório. Estima-se que 99% das bactérias existentes no planeta não sobrevivam em culturas de laboratório.

Na própria terra de origem

Contrariando as expectativas, o grupo de pesquisadores responsável pela identificação da teixobactina, da Universidade Northeastern, em Boston (EUA), desenvolveu um método capaz de recriar as condições ambientais das bactérias de modo que elas se sentissem à vontade em laboratório para produzir suas toxinas.

Em testes com camundongos, o composto se mostrou eficiente tanto contra infecções comuns e de baixa gravidade quanto contra bacilos de alta gravidade e resistentes a medicamentos.

Eles cultivaram as bactérias sobre um microchip coberto com duas camadas semipermeáveis e enterrado em amostras do próprio solo em que esses microrganismos originalmente vivem.

Em testes com camundongos, o composto se mostrou eficiente tanto contra infecções comuns e de baixa gravidade, causadas por bactérias como a Clostridium difficile, que provoca diarreia, quanto contra bacilos de alta gravidade e resistentes a medicamentos, como o Mycobacterium tuberculosis, da tuberculose e contra formas mutantes de bactérias associadas a infecções hospitalares, como o Staphylococcus aureus.

Nova eras

Desde 1987 não eram descobertas novas classes de antibióticos. Para Kim Lewis, líder da pesquisa publicada esta semana na Nature, o trabalho mostra que existem estratégias alternativas para obter compostos eficazes contra bactérias resistentes.

“Fora os benefícios da aplicação imediata da teixobactina, creio que essa pesquisa traz uma mudança de paradigma”, disse em comunicado à imprensa. “Temos dado muito foco a compostos sintéticos e trabalhado na crença de que a resistência a antibióticos é inevitável, mas ainda podemos encontrar compostos aos quais as bactérias não são resistentes.”

Os pesquisadores ainda não sabem dizer se as bactérias podem se tornar resistentes também ao novo antibiótico, mas acreditam que, caso isso ocorra, provavelmente demorará algumas décadas

A resistência a antibióticos é um traço evolutivo das bactérias, adquirido com o tempo de exposição. Os pesquisadores ainda não sabem dizer se as bactérias podem se tornar resistentes também ao novo antibiótico, mas acreditam que, caso isso ocorra, provavelmente demorará algumas décadas.
A Organização Mundial de Saúde (OMS) considera a resistência de bactérias a antibióticos uma séria ameaça. Recentemente, o problema tem chamado a atenção depois de casos recorrentes de infecção por microrganismos resistentes em hospitais. Segundo a Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), no Brasil, a taxa de infecção hospitalar é de 15%, mais alta do que em países da Europa e nos Estados Unidos, onde o mesmo índice é de 10%.

Sofia Moutinho
Ciência Hoje On-line

terça-feira, 8 de julho de 2014

Estudo comprova atividades antioxidante e antimicrobiana da própolis orgânica brasileira

08/07/2014

Por José Tadeu Arantes
Agência FAPESP – O Brasil é o segundo maior produtor mundial de própolis, sendo superado apenas pela China. Das 700 a 800 toneladas de própolis consumidas anualmente no mundo, o país responde por 150 a 170 toneladas, atendendo, entre outros clientes, a 80% da demanda do mercado japonês. No entanto, o número de patentes brasileiras em relação ao produto é, ainda, extremamente baixo. Estima-se que mais de 43% das patentes mundiais com própolis brasileiras tenham sido depositadas por instituições ou empresas do Japão.

Pesquisa investigou 78 amostras, coletadas em diferentes apiários no sul do Paraná e norte de Santa Catarina (foto: Wikimedia)

Há, atualmente, um forte interesse do mercado europeu pela própolis orgânica certificada produzida no Brasil, porque o produto estaria isento de metais pesados e contaminantes microbianos, bem como pela peculiaridade de seu sabor suave. Mas não havia, até recentemente, nenhum estudo atestando que essa própolis fosse capaz de atender às expectativas dos consumidores, que buscam o produto por suas possíveis propriedades antioxidantes, antimicrobianas, anti-inflamatórias, anticariogênicas e até mesmo anticancerígenas.
Um estudo que confirmou as propriedades antioxidantes e antimicrobianas da própolis orgânica certificada produzida na Região Sul do Brasil foi finalizado recentemente pelo engenheiro agrônomo Severino Matias de Alencar, professor associado da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq), da Universidade de São Paulo (USP), com apoio da FAPESP.

Em colaboração com o farmacêutico Pedro Luiz Rosalen, professor titular de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP), da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), e com a participação da doutoranda Ana Paula Tiveron (Esalq) e do pós-doutorando Bruno Bueno Silva (Instituto de Ciências Biomédicas, USP), ambos bolsistas da FAPESP, Alencar investigou 78 amostras, coletadas no sul do Paraná e norte de Santa Catarina, em diferentes apiários.

Nesse total, identificou sete variantes de própolis orgânica, com comprovadas atividades antioxidante (avaliada pelos métodos de sequestro do radical superóxido, do radical peroxila e do ácido hipocloroso) e antimicrobiana (em relação às bactérias Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Staphylococcus aureus, Streptococcus oralis e Pseudomonas aeruginosa).

“Foi uma constatação importante porque havia dúvida em relação a essas própolis orgânicas, por causa dos teores muito baixos de flavonoides, que são as substâncias notoriamente responsáveis pelas propriedades antioxidantes e antimicrobianas das própolis, principalmente de clima temperado. Porém, verificamos que essas mesmas propriedades são exercidas, com igual eficácia, pelos ácidos fenólicos”, disse Alencar à Agência FAPESP. “Constatamos, nas variedades pesquisadas, altos teores de ácidos gálico, cafeico e cumárico, entre outros tipos de ácidos fenólicos.”
Os ácidos fenólicos e os flavonoides pertencem à mesma classe química dos compostos fenólicos, cuja principal característica é a presença em suas moléculas de pelo menos um radical hidroxila ligado a um anel benzênico.

“A atividade antioxidante decorre da doação de elétrons ou íons de hidrogênio (H+), originários da hidroxila, que reduzem os radicais livres oxidantes. Já a atividade antimicrobiana decorre de um entre os três modos de ação seguintes: (1) reação com a membrana celular, alterando sua permeabilidade e causando perda de constituintes celulares ou mudanças conformacionais em ácidos graxos dessa membrana; (2) inativação de sistemas enzimáticos ou de enzimas essenciais, como a H+ATPase; ou (3) suprarregulação ou infrarregulação, envolvendo genes de adaptação ao estresse, glicólises e outros fatores”, explicaram Alencar e Rosalen.
Atividade protetora
A atividade antimicrobiana da própolis já era empiricamente conhecida pelos antigos sacerdotes egípcios, que a utilizavam no processo de embalsamamento, para proteger as múmias do ataque de fungos e bactérias. Há relatos de uso da própolis também na Idade Média, para prevenir infecções no cordão umbilical de recém-nascidos. E, até mesmo na Segunda Guerra Mundial, a própolis foi empregada como agente cicatrizante e antimicrobiano no tratamento de soldados em alguns hospitais da antiga União Soviética.
O produto consiste, basicamente, em uma resina vegetal, exsudada por plantas, e coletada em botões florais pelas abelhas presentes no bioma. As abelhas recolhem a resina e a carregam para a colmeia, onde ela desempenha várias funções úteis, como as de vedação, impermeabilização e assepsia ambiental, entre outras. Foram essas funções, essenciais para a preservação da colmeia, que fizeram com que o material fosse chamado de “própolis” (do grego, pro, “em benefício de”, e polis, “cidade”).
“Muitas plantas secretam resinas para proteger os brotos e as folhas em crescimento. Por causa de sua constituição, rica em compostos fenólicos, essas resinas têm um grande poder antioxidante, antifúngico e antibacteriano. As abelhas raspam as plantas e transportam as resinas”, detalhou Alencar.
“Uma vez na colmeia, a função da própolis é, antes de tudo, de proteção física, pois as abelhas têm fobia à luz e utilizam a resina para vedar as frestas e criar um ambiente penumbroso e termicamente isolado. Em razão de sua ação antimicrobiana, o material funciona também como um poderoso esterilizador, fazendo com que a atmosfera interna da colmeia seja muito mais estéril do que a atmosfera externa.”

Os produtores retiram a própolis, abrindo janelas laterais, de dois a três centímetros de altura, na cobertura resinosa da colmeia – janelas que as abelhas voltam a fechar, com mais resina.
“As amostras que colhemos foram produzidas em áreas de mata nativa ou de reflorestamento. E isso confere à produção da própolis orgânica uma virtude a mais, que é a de estimular a preservação ambiental, indispensável ao êxito do empreendimento”, afirmou o pesquisador.
“A doutoranda Ana Paulo Tiveron está pesquisando, por meio das técnic
as de HPLC semipreparativo e espectrometria de massas, os compostos bioativos responsáveis pela atividade antioxidante. Esperamos que, com a identificação desses compostos biologicamente ativos, possamos ter marcadores químicos para essas própolis”, disse.

“Estamos com os trabalhos bastante adiantados para, muito em breve, depositar patentes associadas à própolis orgânica, garantindo a propriedade intelectual ao país”, acrescentou.
O passo seguinte, já planejado por Alencar e Rosalen, será o estudo da possível atividade anti-inflamatória e antinociceptiva (analgésica) e da citotoxicidade e da ação antiproliferativa (anticancerígena) da própolis orgânica.

Além disso, os pesquisadores pretendem investigar as eventuais diferenças entre as soluções aquosa e alcoólica de própolis. A pesquisa que conduziram até agora foi feita com a solução alcoólica, que é a mais fácil de produzir. Porém, como muitos consumidores não podem ou não querem ingerir álcool, existe uma demanda crescente pelo extrato aquoso. “A empresa que industrializa o produto na região de União da Vitória, no Paraná, está muito interessada em atender esse segmento do mercado e nos solicitou um estudo a respeito”, afirmou Alencar.

domingo, 25 de dezembro de 2011

Fatores reguladores da virulência de Staphylococcus aureus

Publicado em 25/12/2011

Antibióticos, bactérias, infecções, microrganismos são alguns dos assuntos que mais gosto, como meus leitores já devem ter percebido. Já foram postados vários textos neste blog sobre esta temática. Também já escrevi aqui sobre a bactéria patogênica Staphylococcus aureus, que pode ser extremamente nefasta, principalmente se a infecção por esta não for adequadamente tratada.S. aureus, como é conhecida, é uma bactéria danada. Ela possui vários mecanismos de virulência, como proteínas que atuam na adesão desta bactéria a superfícies e na invasão de tecidos de hospedeiros, exoproteínas que atuam contra mecanismos de imunidade, além de também possuir toxinas que causam hemólise (destruição dos hemócitos, ou glóbulos vermelhos) e que formam poros em membranas, permitindo o “vazamento” de íons e outras moléculas pequenas de células de hospedeiros. Para que cause infecção, é necessário que os fatores de virulência de S. aureus atuem de forma coordenada, até mesmo de maneira redundante, de tal forma que se um de seus fatores de virulência for afetado, os outros continuarão ativos.

Staphylococcus aureus
Descobriu-se que S. aureus tem um gene regulador de virulência, denominado agr (accessory gene regulator). Até pouco tempo atrás se sabia que a expressão do gene agr era regulada por um sinalizador químico. E se sabia de que tipo era este sinalizador: uma molécula pequena, da classe dos metabolitos secundários. Também se descobriu que, apesar do gene agr ter uma grande importância na regulação da virulência de S. aureus, este gene não é essencial para a expressão da virulência. São conhecidos isolados clínicos (de hospitais) de S. aureus desprovidos do gene agr.Recentemente, pesquisadores realizaram uma extensa análise do material genético (genoma) de S. aureus, de maneira a verificar a presença de genes reguladores da biossíntese (processo enzimático de várias etapas que é responsável pela formação das moléculas biológicas, como proteínas, açúcares, DNA, RNA, e também de metabolitos secundários) de peptídeos não-ribossômicos exclusivos de S. aureus. Analisando o genoma desta maneira, é possível se detectar a presença de genes que regulam a biossíntese de substâncias específicas, e propor a estrutura química das mesmas, uma vez que estes genes coordenam a ação de enzimas que atuam de maneira bem estabelecida. Foram analisados 50 genomas de S. aureus, e identificado um agregado de genes (gene cluster) responsável pela biossíntese de peptídeos não-ribossomais (ou seja, peptídeos que não são formados nos ribossomos, como são a grande maioria das proteínas, peptídeos muito grandes) ainda desconhecidos. O agregado de genes mostrou ter um gene de 7,17 Kb (1 Kb = 1000 bases nucléicas, que formam o DNA), que ocupa apenas 0,25% do genoma de S. aureus.

Este agregado de genes regula a formação de uma sintetase de peptídeos não-ribossomais (NRPS, non-ribossomal peptide synthetase) de 2389 aminoácidos. Esta NRPS mostrou ter sítios que atuam na formação de um dipeptídeo (um derivado de dois aminoácidos) com estrutura muito peculiar: é formado a partir dos aminoácidos valina e tirosina, que se condensam e dão origem a uma estrutura cíclica, de massa molecular de 262,17 u.m.a.(u.m.a. = unidade de massa atômica). Ou seja, a partir da análise do genoma de S. aureus, foi possível se encontrar genes que regulam a formação deste dipeptídeo, cuja estrutura pôde ser predita a partir dos resultados obtidos da análise do genoma.
Porém, era necessário que esta predição fosse confirmada.
Desta forma, os autores deste estudo cresceram S. aureus em meio de cultura, extraíram o meio de cultura com solventes orgânicos e analisaram os extratos do meio de cultura por cromatografia líquida (HPLC, high-performance liquid chromatography) acoplada a um detector de espectrometria de massas. Desta forma, para cada substância separada foi possível obter um espectro de massas, que indica a massa molecular da forma protonada das substâncias presentes no meio de cultura de S. aureus. Estas análises indicaram a presença de duas substâncias (dentre outras) no extrato orgânico do meio de cultura de S. aureus: uma de massa 262 e outra de massa 246. As duas mostraram ser muito parecidas pelo fato de serem pouco separadas na análise por HPLC, e também por apresentarem espectro no ultravioleta muito similar. Ou seja, talvez estas substâncias apresentassem estruturas muito parecidas, e tivessem uma biossíntese comum.
Esta hipótese foi confirmada após a obtenção das substâncias puras, uma separada da outra. Após isoladas, puderam ser analisadas por várias técnicas espectroscópicas, principalmente por diferentes experimentos de ressonância magnética nuclear (RMN). Estas análises indicaram que um dos dipeptídeos isolados era formado por tirosina e valina (aureusimina A), e o outro por fenilalanina e valina (aureusimina B). A diferença entre os dois é de apenas um átomo de oxigênio.

Para confirmar que estes dois dipeptídeos eram realmente biossintetizados por S. aureus, o gene ausA, supostamente responsável pela regulação da biossíntese destas duas substâncias, foi substituído por um gene artificial. E S. aureus não mais produziu as aureusiminas.Em seguida, foram feitos testes com as duas substâncias (aureusiminas A e B) para verificar como estas influenciavam na expressão do gene agr, que controla a virulência de S. aureus. Observou-se que a substituição do gene ausA de S. aureus, responsável pela biossíntese das auresiminas, por um gene artificial alterou completamente o padrão de expressão do gene agr, responsável pela virulência. Observou-se diminuição na formação de proteínas imunomodulatórias, de proteínas de adesão, bem como de proteínas líticas (que promovem o rompimento de membranas) e de citotoxinas (toxinas de células). Enquanto tais proteínas mostraram ter sua produção estimulada na presença das aureusiminas, na ausência destas substâncias as proteínas virulentas mostraram ser produzidas em quantidades muito menores. Claramente as aureusiminas mostraram atuar na regulação das proteínas participantes do processo de virulência de S. aureus.
Normalmente, S. aureus “original”, sem ter seu genoma alterado, promove hemólise. Quando o gene ausA foi suprimido, a hemólise promovida por S. aureus sem este gene também foi suprimida. Quando se adicinou as aureusiminas no meio de crescimento de S. aureus com seu genoma alterado (com o gene ausA deletado), voltou-se a observar a hemólise. Claramente as aureusiminas participam diretamente da ativação dos processos de virulência de S. aureus.
E mais: quando camundongos sadios foram infectados com S. aureus “original” (sem ter seu genoma alterado), os bichinhos apresentaram grande quantidade de unidades formadoras de colônia (um indicativo de proliferação bacteriana) em seus rins, fígado, baço e coração. Quando os camundongos foram infectados com S. aureus mutada, com o gene ausA suprimido, observou-se que os rins apresentaram grau de infecção, mas os outros três órgãos muito menos, principalmente o coração (praticamente sem infecção). Ou seja, a inibição da biossíntese das aureusiminas levou a um grau de infecção virulenta muito menor.
A descoberta que as aureusiminas controlam a virulência de S. aureus abre um enorme conjunto de possibilidades para o desenvolvimento de novas formas de tratamento de infecções por esta bactéria. Por exemplo, a eventual descoberta de inibidores da biossíntese das aureusiminas pode significar a abolição do uso de antibióticos para o tratamento de infecções por S. aureus. Embora tal perspectiva possa parecer distante, tudo depende do esforço de pesquisadores acadêmicos e de indústrias farmacêuticas sérias. O mecanismo de ação de tais agentes inibidores da virulência de S. aureus seria completamente diferente do mecanismo de ação dos antibióticos. Isso porque os inibidores da biossíntese das aureusiminas interferem no processo bioquímico de formação destas substâncias, muito mais difícil de sofrer uma mutação benéfica para continuar promovendo a virulência. Desta forma, não seria mais necessário utilizar antibióticos, dos quais as bactérias adquirem resistência (através de mutações) em poucas gerações.

Infecção causada por S. aureus (nojenta!)
Embora o trabalho realizado com S. aureus pareça muito complicado, realmente não é. As atuais ferramentas bioquímicas permitem a realização de um trabalho deste em tempo relativamente curto. Na verdade, os autores mencionam um trabalho publicado em 2008 como fonte das informações preliminares nas quais se basearam para realizar seu estudo. A referência original indica que este trabalho (Novick e Geisinger) foi publicado on-line em agosto de 2008. Ou seja, o estudo realizado com S. aureus levou, no máximo, menos de dois anos para ser desenvolvido. Uma boa idéia e abordagens e estratégias de trabalho bem delineadas levaram à publicação de um artigo extramemente relevante na Science, uma vez que as infecções causadas por S. aureus são consideradas um dos maiores problemas de saúde pública no mundo.O que certamente fez a diferença para um trabalho deste ter sido feito em tão pouco tempo? Acesso a instrumentação e aos materiais (reagentes, linhagens bacterianas, camundongos) necessários para o desenvolvimento deste projeto. Sem entraves, sem burocracia, sem demora, sem falta de dinheiro.

Wyatt, M., Wang, W., Roux, C., Beasley, F., Heinrichs, D., Dunman, P., & Magarvey, N. (2010). Staphylococcus aureus Nonribosomal Peptide Secondary Metabolites Regulate Virulence Science, 329 (5989), 294-296 DOI: 10.1126/science.1188888

Novick, R., & Geisinger, E. (2008). Quorum Sensing in Staphylococci Annual Review of Genetics, 42 (1), 541-564 DOI: 10.1146/annurev.genet.42.110807.091640

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