What Is CRISPR?
No uso popular, "CRISPR" (pronuncia-se "crisper") é abreviação de "CRISPR-Cas9". CRISPRs são trechos especializados de DNA. A proteína Cas9 (ou "associada a CRISPR") é uma enzima que age como um par de tesouras moleculares, capazes de cortar fitas de DNA.
A tecnologia CRISPR foi adaptada a partir dos mecanismos naturais de defesa de bactérias e archaea (o domínio dos microrganismos unicelulares).
Esses organismos usam RNA derivado de CRISPR e várias proteínas Cas, incluindo Cas9, para impedir ataques de vírus e outros corpos estranhos. Eles o fazem basicamente cortando e destruindo o DNA de um invasor estrangeiro. Quando esses componentes são transferidos para outros organismos mais complexos, ele permite a manipulação de genes, ou "edição".
Até 2017, ninguém sabia realmente como era esse processo. Em um artigo publicado 10 de novembro de 2017, na revista Nature Communications, uma equipe de pesquisadores liderados por Mikihiro Shibata, da Universidade de Kanazawa e Hiroshi Nishimasu da Universidade de Tóquio mostrou o que parece que quando um CRISPR está em ação pela primeira Tempo. [A Breathtaking New GIF Shows CRISPR Chewing Up DNA]
CRISPR-Cas9: Os principais jogadores
CRISPRs: "CRISPR" significa "grupos de repetições palíndrromes curtas com intervalos regulares". É uma região especializada do DNA com duas características distintas: a presença de repetições de nucleotídeos e espaçadores. Seqüências repetidas de nucleotídeos - os blocos de construção do DNA - são distribuídas por toda a região CRISPR. Espaçadores são pedaços de DNA que são intercalados entre essas seqüências repetidas.No caso de bactérias, os espaçadores são retirados de vírus que atacaram o organismo anteriormente. Eles servem como um banco de memórias, o que permite que as bactérias reconheçam os vírus e combatam futuros ataques.
Isso foi demonstrado pela primeira vez experimentalmente por Rodolphe Barrangou e uma equipe de pesquisadores da Danisco, uma empresa de ingredientes alimentícios. Em um artigo de 2007 publicado na revista Science, os pesquisadores usaram as bactérias Streptococcus thermophilus, que são comumente encontradas em iogurtes e outras culturas lácteas, como modelo. Eles observaram que após um ataque de vírus, novos espaçadores foram incorporados na região CRISPR. Além disso, a sequência de DNA desses espaçadores era idêntica a partes do genoma do vírus. Eles também manipularam os espaçadores retirando-os ou colocando novas seqüências de DNA viral. Desta forma, eles foram capazes de alterar a resistência das bactérias a um ataque por um vírus específico. Assim, os pesquisadores confirmaram que os CRISPRs desempenham um papel na regulação da imunidade bacteriana.
CRISPR RNA (crRNA): Uma vez que um espaçador é incorporado e o vírus ataca novamente, uma parte do CRISPR é transcrita e processada em RNA CRISPR, ou "crRNA". A sequência nucleotídica do CRISPR actua como molde para produzir uma sequência complementar de ARN de cadeia simples. Cada crRNA consiste em uma repetição de nucleotídeos e uma porção espaçadora, de acordo com uma revisão de 2014 por Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier, publicada na revista Science.
Cas9: A proteína Cas9 é uma enzima que corta DNA estranho.
A proteína tipicamente se liga a duas moléculas de RNA: o crRNA e outro chamado tracrRNA (ou "crRNA trans-ativador"). Os dois então guiam Cas9 para o local de destino onde ele fará o seu corte. Essa extensão de DNA é complementar a um trecho de 20 nucleotídeos do crRNA. Usando duas regiões separadas, ou "domínios" em sua estrutura, Cas9 corta ambos os filamentos da dupla hélice do DNA, fazendo o que é conhecido como "quebra dupla", de acordo com o artigo de 2014 da Science.
Existe um mecanismo de segurança embutido, que garante que o Cas9 não
seja cortado em nenhum lugar do genoma. Sequências curtas de ADN
conhecidas como PAM ("motivos adjacentes de proto-espaciais") servem
como marcadores e são adjacentes à sequência de ADN alvo. Se o complexo
Cas9 não vir um PAM próximo a sua sequência de DNA alvo, ele não será
cortado. Esta é uma das razões possíveis pela qual o Cas9 nunca ataca a
região CRISPR em bactérias, de acordo com uma revisão de 2014 publicada
na Nature Biotechnology.
CRISPR-Cas9 como uma ferramenta de edição de genoma
Os genomas de vários organismos codificam uma série de mensagens e
instruções dentro de suas seqüências de DNA. A edição do genoma envolve a
alteração dessas sequências, alterando assim as mensagens. Isso pode
ser feito inserindo um corte ou quebra no DNA e enganando os mecanismos
naturais de reparo de DNA de uma célula para introduzir as mudanças que
se deseja. O CRISPR-Cas9 fornece um meio para isso.
Em 2012, dois trabalhos de pesquisa foram publicados nos periódicos
Science e PNAS, que ajudaram a transformar o CRISPR-Cas9 bacteriano em
uma ferramenta simples e programável de edição do genoma.
Os estudos, conduzidos por grupos separados, concluíram que Cas9
poderia ser direcionado para cortar qualquer região do DNA. Isso poderia
ser feito simplesmente mudando a seqüência de nucleotídeos do crRNA,
que se liga a um alvo de DNA complementar. No artigo de 2012 da Science,
Martin Jinek e colegas simplificaram ainda mais o sistema ao fundir
crRNA e tracrRNA para criar um único "RNA guia". Assim, a edição do
genoma requer apenas dois componentes: um RNA guia e a proteína Cas9.
"Operacionalmente, você projeta um trecho de 20 pares de bases
[nucleotídicas] que combinam com um gene que você deseja editar", disse
George Church, professor de genética na Harvard Medical School. Uma
molécula de RNA complementar aos 20 pares de bases é construída. Church
enfatizou a importância de garantir que a seqüência de nucleotídeos seja
encontrada apenas no gene alvo e em nenhum outro lugar do genoma.
"Então o RNA mais a proteína [Cas9] cortará - como um par de tesouras - o
DNA naquele local, e idealmente em nenhum outro lugar", explicou ele.
Once the DNA is cut, the cell's natural repair mechanisms kick in and
work to introduce mutations or other changes to the genome. There are
two ways this can happen. According to the Huntington's Outreach Project at Stanford (University),
one repair method involves gluing the two cuts back together. This
method, known as "non-homologous end joining," tends to introduce
errors. Nucleotides are accidentally inserted or deleted, resulting in mutations,
which could disrupt a gene. In the second method, the break is fixed by
filling in the gap with a sequence of nucleotides. In order to do so,
the cell uses a short strand of DNA as a template. Scientists can supply
the DNA template of their choosing, thereby writing-in any gene they
want, or correcting a mutation.
Utility and limitations
CRISPR-Cas9 has become popular in recent years. Church notes that the
technology is easy to use and is about four times more efficient than
the previous best genome-editing tool (called TALENS).
In 2013, the first reports of using CRISPR-Cas9 to edit human cells in
an experimental setting were published by researchers from the
laboratories of Church and Feng Zhang
of the Broad Institute of the Massachusetts Institute of Technology and
Harvard. Studies using in vitro (laboratory) and animal models of human
disease have demonstrated that the technology can be effective in
correcting genetic defects. Examples of such diseases include cystic fibrosis, cataracts and Fanconi anemia,
according to a 2016 review article published in the journal Nature
Biotechnology. These studies pave the way for therapeutic applications
in humans.
"I think the public perception of CRISPR is very focused on the idea of
using gene editing clinically to cure disease," said Neville Sanjana of
the New York Genome Center and an assistant professor of biology,
neuroscience and physiology at New York University. "This is no doubt an
exciting possibility, but this is only one small piece."
CRISPR technology has also been applied in the food and agricultural
industries to engineer probiotic cultures and to vaccinate industrial
cultures (for yogurt, for example) against viruses. It is also being
used in crops to improve yield, drought tolerance and nutritional
properties.
One other potential application is to create gene drives. These are
genetic systems, which increase the chances of a particular trait
passing on from parent to offspring. Eventually, over the course of
generations, the trait spreads through entire populations, according to
the Wyss Institute.
Gene drives can aid in controlling the spread of diseases such as
malaria by enhancing sterility among the disease vector — female Anopheles gambiae mosquitoes — according to the 2016 Nature Biotechnology article. In addition, gene drives could also be used to eradicate invasive species and reverse pesticide and herbicide resistance, according to a 2014 article by Kenneth Oye and colleagues, published in the journal Science.
However, CRISPR-Cas9 is not without its drawbacks.
"I think the biggest limitation of CRISPR is it is not a hundred
percent efficient," Church told Live Science. Moreover, the
genome-editing efficiencies can vary. According to the 2014 Science
article by Doudna and Charpentier, in a study conducted in rice, gene
editing occurred in nearly 50 percent of the cells that received the
Cas9-RNA complex. Whereas, other analyses have shown that depending on
the target, editing efficiencies can reach as high as 80 percent or
more.
There is also the phenomenon of "off-target effects," where DNA is cut
at sites other than the intended target. This can lead to the
introduction of unintended mutations. Furthermore, Church noted that
even when the system cuts on target, there is a chance of not getting a
precise edit. He called this "genome vandalism."
Definindo limites
As muitas aplicações potenciais da tecnologia CRISPR levantam questões sobre os méritos e consequências éticos de adulteração de genomas.
No artigo de 2014 da Science, Oye e colegas apontam para o potencial impacto ecológico do uso de drives genéticos. Um traço introduzido poderia se espalhar além da população-alvo para outros organismos através do cruzamento. Os drives genéticos também podem reduzir a diversidade genética da população-alvo.
Fazer modificações genéticas em embriões humanos e células reprodutivas, como espermatozoides e óvulos, é conhecido como edição germinal. Como as alterações nessas células podem ser passadas para as gerações subsequentes, o uso da tecnologia CRISPR para fazer edições germinativas gerou uma série de preocupações éticas.
Variable efficacy, off-target effects and imprecise edits all pose
safety risks. In addition, there is much that is still unknown to the
scientific community. In a 2015 article published in Science, David
Baltimore and a group of scientists, ethicists and legal experts note
that germline editing raises the possibility of unintended consequences for future generations
"because there are limits to our knowledge of human genetics,
gene-environment interactions, and the pathways of disease (including
the interplay between one disease and other conditions or diseases in
the same patient)."
Other ethical concerns are more nuanced. Should we make changes that
could fundamentally affect future generations without having their
consent? What if the use of germline editing veers from being a
therapeutic tool to an enhancement tool for various human
characteristics?
To address these concerns, the National Academies of Sciences, Engineering and Medicine put together a comprehensive report with guidelines and recommendations for genome editing.
Although the National Academies urge caution in pursuing germline
editing, they emphasize "caution does not mean prohibition." They
recommend that germline editing be done only on genes that lead to
serious diseases and only when there are no other reasonable treatment
alternatives. Among other criteria, they stress the need to have data on
the health risks and benefits and the need for continuous oversight
during clinical trials. They also recommend following up on families for
multiple generations.
Recent research
Tem havido muitos projetos de pesquisa recentes baseados em CRISPR. "O ritmo das descobertas de pesquisa básica explodiu, graças ao CRISPR", disse o especialista em bioquímica e CRISPR Sam Sternberg, líder do grupo de desenvolvimento de tecnologia da Caribou Biosciences Inc., que está desenvolvendo soluções baseadas em CRISPR para medicina, agricultura e pesquisa biológica.
Aqui estão algumas das descobertas mais recentes:
- In April 2017, a team of researchers released research in the journal Science that they had programmed a CRISPR molecule to find strains of viruses, such as Zika, in blood serum, urine and saliva.
- On Aug. 2, 2017, scientists revealed in the journal Nature that they had removed a heart disease defect in an embryo successfully using CRISPR.
- On Jan. 2, 2018, researchers announced that they may be able to stop fungi and other problems that threaten chocolate production using CRISPR to make the plants more resistant to disease.
- On April 16, 2018, researchers upgraded CRISPR to edit thousands of genes at once, according to research published by the journal BioNews.
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